以下文章来源于作图丫 ，作者月野兔
导语：越来越多的证据表明，巨噬细胞亚型的激活状态和多样化谱在肿瘤微环境中表现出动态异质性，这在多种癌症类型中发挥着关键作用。
背景介绍
今天小编为大家带来的这篇文章，作者探讨了不同巨噬细胞亚型的异质性和稳态及其对卵巢癌（OV）生物学和临床表现的影响。文章发表在《Journal of Advanced Research》上，影响因子为：12.822，文章题目为：Integrated immunogenomic analysis of single-cell and bulk tissue transcriptome profiling unravels a macrophage activation paradigm associated with immunologically and clinically distinct behaviors in ovarian cancer。
数据介绍
OV 患者的大量肿瘤 RNA-seq 数据和临床信息来自基因表达综合库 (GEO)、癌症基因组图谱 (TCGA)、ArrayExpress 数据库和 PubMed 中发表的文献。从 GEO 获得了五个独立 OV 样本的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 概况和临床信息。
技术路线
本研究技术路线如图所示。
结果解析
01
公共OV数据集的免疫基因组特征揭示了巨噬细胞在OV预后和化疗中的关键作用
本研究首先定量估计了 TME 中免疫浸润的细胞组成，并使用单因素 Cox 回归分析评估了 18 个公开可用的 OV 队列中每种免疫细胞类型的预后影响以及总体生存信息。然后使用荟萃分析来利用 18 个 OV 队列对每种免疫细胞类型进行总体预后评估。汇总结果表明，幼稚 CD4 T 细胞浸润，静息 CD4 记忆 T 细胞、M2巨噬细胞和嗜酸性粒细胞与不良预后相关。相比之下，活化的 CD4 记忆 T 细胞、M0 巨噬细胞和 M1 巨噬细胞的浸润与预后改善相关（图 1A）。生存分析显示，幼稚 CD4 T 细胞、静息记忆 CD4 T 细胞、M2 巨噬细胞或嗜酸性粒细胞浸润低的患者的 OS 明显长于浸润高的患者，而活化 CD4 记忆 T 细胞、M0 巨噬细胞或嗜酸性粒细胞浸润低的患者的 OS 明显更长。与高浸润巨噬细胞相比，M1 巨噬细胞的 OS 显著缩短（图 1B ）。
图 1
接下来，本研究在 11 个具有可用化疗信息的公共 OV 队列中进一步检查了每种免疫细胞类型与化疗反应之间的关联。化疗敏感和化疗耐药患者中九种免疫细胞类型的浸润丰度存在显著差异（图1C）。化疗敏感患者中记忆 B 细胞、滤泡辅助 T 细胞、M0 巨噬细胞、M1 巨噬细胞、活化树突状细胞和 cd T 细胞明显更丰富。相比之下，化疗耐药患者中初始 B 细胞、静息 NK 细胞和静息 CD4 记忆 T 细胞的浸润丰度增加。为了进一步验证巨噬细胞在OV中的临床意义，本研究进行了免疫组化检测17例OV患者（包括10例复发患者和7例未复发患者）M1巨噬细胞标志物（CD86）和M2巨噬细胞标志物（CD206）的表达情况。代表性图像如图 1D 所示。如图1D所示，非复发患者组织中CD86的表达水平显著高于复发患者组织，而非复发患者组织中CD206的表达水平显著低于复发患者组织 (图 1D)。这些结果表明巨噬细胞的功能复杂性与 OV 的预后和治疗效果相关。
02
单细胞转录组分析证实巨噬细胞的功能状态与化疗反应的关联
然后本研究检查了 5 名 OV 患者的 scRNA-seq 数据。经过质量控制并排除任何批次效应后，对 40,218 个单细胞进行了分析，其中 31,358 个单细胞来自化疗耐药患者，8,860 个来自敏感患者。40,218 个单细胞聚集成八个群体。使用细胞特异性标记物，本研究鉴定了四种免疫细胞类型，即 T/自然杀伤 (NK) 细胞、B 细胞、骨髓细胞和浆细胞样树突状细胞，以及四种非免疫细胞类型（成纤维细胞以及系膜细胞、内皮细胞和上皮细胞）（图2A）。化疗耐药样本中成纤维细胞、骨髓细胞和上皮细胞高度富集，而化疗敏感样本中 B 和 T/NK 细胞过多（图 2B）。
随后，本研究单独分析骨髓细胞。骨髓细胞进一步分为5个巨噬细胞亚群、2个骨髓树突细胞亚群和1个单核细胞亚群（图2C）。Macro-C1特异性表达趋化因子基因[CCL3、CCL4和CCL5]，显示M1（TNF）和M2（CD206和硒蛋白P）巨噬细胞标记物的共表达，表明复杂的极化表型（图 2C 和 D)。Macro-C2 表现出补体 C1q 表达水平增加，这可能驱动 TAM 进行 M2 极化。Macro-C3 表现出 FTL 表达水平增加。此外，macro-C4 表达高水平的分泌型磷蛋白 1 (SPP1)，这是与肿瘤血管生成相关的 M2 巨噬细胞的标志物。Macro-C5 表现出高水平的 M0 巨噬细胞标记物表达，对应于静息巨噬细胞表型。此外，宏C5亚簇表达高水平的促炎细胞因子和趋化因子（CCL7、CCL20和IL6；图2D），表明向M1表型的极化。这些结果表明，macro-C2、-C3和-C4簇对应于M2样巨噬细胞，macro-C5簇对应于M1样巨噬细胞。
图 2
此外，本研究还观察到巨噬细胞亚簇分布的差异。 M2 样巨噬细胞在化疗耐药患者中占主导地位，而化疗敏感患者的样本则富含宏 C5 簇（图 2E）。随后，对化疗耐药和化疗敏感样本的巨噬细胞亚簇进行层次聚类和KEGG通路富集分析，观察到不同的表达模式（图2F）。来自化疗耐药组的巨噬细胞亚群表达参与多种疾病相关通路（例如“脂质和动脉粥样硬化”和“类风湿关节炎”）的基因。相比之下，来自化疗敏感组的巨噬细胞亚群富含免疫和抗肿瘤相关通路（“IL-17信号通路”和“TNF信号通路”）。因此，scRNA-seq 分析支持了大量组织转录组学的发现，并表明巨噬细胞的激活状态与化疗反应相关。
03
巨噬细胞的功能状态可识别临床上不同的患者亚组
然后本研究探讨了不同巨噬细胞亚型的相对浸润丰度与患者预后之间的关系。根据M0、M1和M2巨噬细胞浸润丰度中位数，总共2,791个OV样本分为八类（图3A）。本研究观察到八组之间 OS 存在显著差异，与其他组相比，M0hi M1hi M2lo 组的患者表现出更好的 OS（图 3B）。
此外，本研究还分析了巨噬细胞浸润对总体缓解率的影响。结果表明，M0hi M1hi M2lo组患者对化疗的反应率最高（82％），而M0lo M1lo M2hi组患者的反应率最低（59％）（图3C）。无监督的共识聚类分析能够识别具有不同巨噬细胞功能状态的两个不同的患者亚组（图3D）。如图3D所示，簇1的特点是M0和M1巨噬细胞丰度较高（此后称为UnPol亚型），而簇2则显示出高丰度的M2巨噬细胞和相对较低水平的M0和M1巨噬细胞（称为M2Pol亚型）。生存分析表明，与 M2Pol 亚型相比，UnPol 亚型与 OS 改善相关（图 3E）。还值得注意的是，UnPol 亚型在化疗反应率方面与 M2Pol 亚型明显不同（图 3F）。此外，TCGA定义的分子亚型（分化型、免疫反应型、间充质型和增殖型）几乎可以同等地分为使用本研究的方法鉴定的UnPol和M2Pol亚型，这证明了这两种亚型的实用性（图3G）。此外，通过多因素 Cox 回归分析调整其他临床特征后，这种基于巨噬细胞的亚型分类与 OS 保持显著相关（图 3H）。总而言之，这些结果表明 TME 中的巨噬细胞极化显著区分 OV 患者的临床结果。
图 3
04
巨噬细胞的功能状态区分免疫学上不同的亚群
本研究进一步探讨了可能导致亚群免疫行为差异的巨噬细胞的功能状态。首先从Vidotto等人的研究中获得了一组63个免疫调节基因，包括免疫激活剂和抑制剂，然后计算ssGSEA评分来评估免疫激活或抑制的程度。如图4A所示，与UnPol相比，M2Pol亚型表现出更高的免疫刺激和免疫抑制亚型，表明不同的机制可能有助于两种亚型之间的肿瘤免疫逃逸。
此外，本研究分析了免疫检查点分子的平均表达水平，发现与UnPol亚型相比，M2Pol中的表达量更高（图4B）。主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类以及非经典MHC分子（抗原呈递分子）在M2Pol亚型中也上调（图4B）。还分析了化疗耐药和敏感患者的单细胞转录组数据中 MHC 和免疫检查点分子的表达水平。结果发现，与敏感患者相比，耐药患者巨噬细胞表达的MHC和免疫检查点分子水平显著升高（图4C）。抗原呈递分子表达的差异与T细胞和巨噬细胞有关，这些结果表明M2Pol亚型肿瘤表达免疫检查点分子以逃避免疫监视。
图 4
本研究在 UnPol 和 M2Pol 亚组中检查了促炎细胞因子和趋化因子的表达水平。促炎细胞因子优先在UnPol亚型中表达，而抗炎细胞因子的表达主要在M2Pol亚型中（图4D）。使用肿瘤中巨噬细胞群的趋化因子，趋化因子表达在不同状态下是可变的（图4D）。肿瘤抑制因子 CCL14 在 M2Pol 亚型中表达上调。相比之下，UnPol 亚型中促炎趋化因子 CXCL5 和 CXCL1 上调。
为了具体评估外源性免疫逃避因素，本研究比较了UnPol亚型和M2Pol亚型之间TME中不同免疫细胞亚群的分布和相对丰度。如图4E所示，免疫抑制细胞亚群在M2Pol亚型中富集，表明免疫抑制细胞的增加可能有助于M2Pol亚型的免疫逃逸。为了进一步检查UnPol和M2Pol亚型的肿瘤是否表现出不同的生物学特征，本研究计算了每个样本的标志基因集的ssGSEA评分，并鉴定了参与细胞周期、炎症、免疫反应和细胞代谢的差异表达基因模块（图4F）。UnPol亚型的特点是细胞周期通路高度激活，而M2Pol亚型则具有更高的免疫反应。
05
MacroANN预测患者结果和治疗效果
考虑到巨噬细胞的激活与肿瘤生物学和临床行为之间的关联，本研究在训练队列中开发了巨噬细胞极化衍生的人工神经网络模型（称为MacroANN）来预测临床结果和治疗效果（图5A）。当应用于测试队列时，MacroANN 区分了是否从化疗中受益的患者，受益组和无受益组的响应率为 78.40% 和 68.75%（图 5B）。受益组的患者比无受益组的患者生存时间显著延长（图 5B）。受益组患者的5年OS率为38.13%，而无受益组患者的5年OS率为29.20%。
图 5
为了进一步测试 MacroANN 是否为免疫治疗反应提供额外的预测价值，MacroANN 被应用于三个免疫治疗队列。该模型对临床获益做出了准确的预测，并将患者分为获益组和无获益组。与无受益组的患者相比，预测受益组的患者有更高的反应率。Van Allen、Hugo 和 Gide 队列中受益组患者的缓解率分别为 42.31%、65% 和 88.24%。这些高于无获益组患者的相应缓解率（分别为 25%、28.57% 和 73.33%）（图 5C）。此外，生存分析的结果表明，预测的获益组与 OS 改善显著相关（图 5D）。这些结果表明 MacroANN 可以预测临床结果以及对化疗和免疫治疗的反应。
小编总结
本研究对单细胞和大量组织转录组图谱进行整合免疫基因组分析，系统地研究巨噬细胞活化与预后和治疗效果之间的关联。使用共识聚类分析来定义新的巨噬细胞亚型。使用人工神经网络来模拟巨噬细胞的动态激活。全队列结果表明，M0 和 M1 巨噬细胞的相对高浸润丰度与改善的结果和治疗效果相关。然而，M2 巨噬细胞则相反。无监督共识聚类分析揭示了两个 OV 亚群，其特征是 M0、M1 和 M2 巨噬细胞之间的平衡，具有不同的临床和免疫学行为。最后，提出了一种巨噬细胞极化衍生的人工神经网络模型作为治疗效果的稳健预后因素和预测生物标志物，并在不同的独立患者队列中得到了验证。
本研究有一些局限性。首先，仅研究了三种主要的巨噬细胞亚型（M0、M1和M2），其他巨噬细胞亚型应在单细胞水平上进一步研究。其次，没有可用的免疫阻断疗法治疗的 OV 数据集。因此，该模型对免疫检查点抑制剂治疗反应的预测价值需要进一步检验。此外，源样本之间的时空差异也会影响分析，应在进一步的研究中予以考虑。
总之，本研究对 OV 患者的单细胞和大量组织 RNA-seq 数据进行了综合免疫基因组分析，并定义了两种以巨噬细胞表型差异为特征的新亚型。这两种巨噬细胞驱动的亚型与预后和治疗效果以及可能塑造 TME 的生物学和免疫学特征相关。还开发了一种人工神经网络模型来模拟巨噬细胞的动态激活，这可以作为 OV 患者对化疗或免疫治疗反应的强大预测工具。这些发现为巨噬细胞异质性及其与 OV 预后的关系提供了新的见解。这项研究还强调了基于巨噬细胞激活的肿瘤预防和治疗的未来临床潜力。
转自：“SCI科研力”微信公众号
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