以下文章来源于作图丫 ，作者球球
导语：癌症相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境中的多样化细胞群，它们对肿瘤演变和患者预后具有关键影响。
背景介绍
今天小编为大家带来一篇发表在NC的新热点：整合单细胞和空间蛋白组数据对癌症相关成纤维细胞进行分型。题目为Cancer-associated fibroblast classification in single-cell and spatial proteomics data。
数据介绍
来自14名乳腺癌患者肿瘤组织的16,000多个基质细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集。
技术路线
结果解析
01
乳腺癌成纤维细胞的分类
为了识别和分类CAF类型，作者分析了先前从14例人类乳腺癌标本中生成的scRNA-seq数据集，其中基于无监督聚类鉴定了16,704个基质细胞(总共约119,000个细胞)。在这些基质细胞中，共鉴定出14315个CAFs，使用这个数据集来研究乳腺肿瘤中成纤维细胞的表型异质性。
在批量校正后，对所有基质细胞的单细胞基因表达谱进行无监督分层聚类，识别出12个cluster。然后，作者检查了每个cluster相对于所有其他cluster的最高差异表达基因(MAST27)(图2a, b)。基于功能相关的高重叠，手动合并了两个cluster的差异表达基因，总共产生了10种细胞类型。使用基因集富集分析来识别每种细胞类型富集的标志通路(图2c)。基于这些分析，将这些cluster标注为9种CAF类型和1种周细胞簇。
CAF类型为：基质CAFs (mCAFs)、炎性CAFs (iCAFs)、血管CAFs (vCAFs)、血管CAFs (vCAFs)、肿瘤样CAFs (tCAFs)、cluser2tCAFs (n = 722)、干扰素应答型CAFs (ifnCAFs)、抗原呈递CAFs (apCAFs)、网状样CAFs (rCAFs)、分裂CAFs (dCAFs)。
02
通用的CAF分类方案
为了测试分类方案是否独立于肿瘤类型，接下来研究了四个公开的scRNA-seq数据集的CAF异质性，这些数据集来自非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、胰腺导管癌(PDAC)和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
在肺癌数据集中，通过汇集来自先前研究的测试和验证队列的原始数据来增加成纤维细胞的数量，结果定义了1377个CAFs和574个来自邻近健康组织的细胞。结肠癌数据集包含1568个来自肿瘤的CAFs和1917个来自健康组织的细胞。PDAC数据集包含1762个来自肿瘤组织的成纤维细胞。HNSCC数据集包含1354个我们鉴定为成纤维细胞的细胞。综上所述，集成数据集包含来自四种不同原发肿瘤类型的5723个CAFs(图3a)。
作者使用了两步方法来识别集成数据集中的CAF类型并验证发现。首先对整合数据集的完整单细胞基因表达谱进行了无偏聚类，并确定了之前定义的所有CAF类型以及周细胞(图3b, c)。所有CAF类型在所有癌症类型中都被检测到(图3d)。
对该集成数据集的分析得出了与乳腺癌数据集中鉴定的每种CAF类型相似的顶级差异表达基因(图3b, c, e)。GSEA分析显示，在60-80%的病例中，乳腺癌数据集中的前五种富集途径也在集成数据集中富集。在为CAF类型的功能注释提供信息的通路中，存在特别强的重叠。具体而言，综合数据集中富集最多的5条通路包括tCAFs中的缺氧、mCAFs中的EMT通路和KRAS信号、iCAFs中的IL6-JAK-STAT信号、apCAFs中的异体移植排斥、dCAFs中的E2F靶点和G2M检查点，所有这些通路都与乳腺癌数据集中富集最多的通路重叠(图3f)。
03
乳腺癌中CAF表型的空间分布
使用multiplexed IMC40来分析来自相同患者的乳腺癌样本中作者定义的CAF表型的空间分布，并使用scRNA-seq进行分析。IMC分析也能够在蛋白质水平上验证作者的发现。
使用scRNA-seq数据来指导41-plex抗体面板的设计，以区分不同的CAF表型(图4a)。使用FAP和PDPN的表达来区分肌成纤维细胞和FAP CAFs。作者没有在IMC中发现apCAFs，因为HLA-DR在基质中的髓系细胞中高度表达，导致高信号重叠。IMC抗体小组还包括标记物，允许识别肿瘤细胞和免疫细胞，重点是t细胞亚型(图4a)。使用IMC面板中41个标记的CAF靶向子集对scRNA-seq数据进行聚类显示，可以恢复所有已定义的CAF类型。
作者用41 plex IMC抗体面板对12个乳腺肿瘤样本(通过scRNA-seq分析的14个患者样本中有12个匹配的组织样本)进行了染色，并检测了基质、肿瘤和免疫细胞。根据免疫荧光成像选择基质丰富的区域和三级淋巴结构(TLS)区域，然后用IMC分析这些选择的区域(每个患者7-13个，取决于可见TLS的数量)。
经过单细胞分割，共鉴定出222,318个肿瘤细胞、104,767个免疫细胞和140,999个CAFs，以及29,635个内皮细胞和55,402个其他细胞。在IMC数据集中发现了大多数scRNA序列定义的CAF亚型(图4b, c)。作者检测到了mCAFs、iCAFs、vCAFs、缺氧和非缺氧tCAFs、ifnCAFs和rCAFs，但没有dCAFs。大多数患者样本包括多种CAF类型(图4d)。
为了研究CAF类型的空间分布，作者进行了邻域分析，在所有成像区域中，量化了给定细胞类型30 μ m半径内的细胞类型。vCAFs与内皮细胞的平均相互作用评分最高(图4e)，并且在图像中仅在内皮细胞周围的血管样结构中发现(图4c)。rCAFs经常出现在具有TLS样结构的图像中，它们包围着聚集的免疫细胞(主要是CD20 B细胞)(图4c)，并且在具有TLS结构的图像中进一步显示出富集的趋势(图4f)。
邻域分析显示，iCAFs与vCAFs和内皮细胞都相邻(图4c, e)。在CAF类型中，只有CD10/CD73 tCAFs和ifnCAFs在邻域分析中与肿瘤细胞表现出积极的相互作用评分，表明iCAFs与肿瘤接近(图4e)。通过比较所有CAF类型到肿瘤间质边界的距离进一步研究了这一点。ifnCAFs离肿瘤细胞最近，中位距离为4µm，其次是tCAFs，中位距离为14µm )，从而证实了这两种CAF类型与肿瘤细胞的距离相对较近。
04
总结
除了显示乳腺肿瘤内各种CAF类型的空间分布外(图5)，该IMC分析进一步验证了基于scRNA - seqCAF分类系统，并表明大多数CAF类型可以在成像数据中识别，每种类型仅2-5个标记(表1)。如果要区分周细胞，还需要三个额外的标记。总的来说，作者证明这种分类方案确定了多种癌症类型中生物学上可解释的CAF表型，这表明它将作为未来成纤维细胞生物学研究的框架。
小编总结
目前需要一个通用的CAF分类系统，以便在研究之间对CAF类型进行简单的比较。本研究基于scRNA-seq数据中CAF类型的文献驱动注释，提出了这样一个CAF分类系统，为这些CAF类型提供了一组标记，并使用多重成像来分析它们在乳腺肿瘤中的空间分布和细胞相互作用。基于对来自14例人类乳腺癌肿瘤样本的16,000多个基质细胞的scRNA-seq数据的分析，结合匹配样本的多重单细胞成像，确定了9种CAF类型和周细胞的标记物表达和空间分布。基于先前发表的scRNA-seq数据，作者进一步在另外四种癌症类型中确定了这些CAF表型，这表明这些表型和分类系统是可推广的。
转自：“SCI科研力”微信公众号
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