经典名方黄连汤（Huanglian Decoction）出自《伤寒论》（东汉·张仲景），被收载于《古代经典名方目录（第一批）》[1]。全方由黄连、甘草（炙）、干姜、桂枝（去皮）、人参、半夏（洗）、大枣（擘）7味药组成，主治伤寒胸中有热，胃中有邪气，腹中痛，欲呕吐者[2]。现代黄连汤及其加减方常用于治疗胃肠疾病、妇科疾病及其他疾病，效果显著[3-4]。经典名方制剂研发是近年来中药新药研发热点。根据国家药品监督管理局发布《古代经典名方关键信息表（25首方剂）（征求意见稿）》[5]、《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》[6]（简称《原则》），制剂研究应以制剂质量与基准样品质量基本一致为目标。但在现代大生产中，中试产品的质量易受提取方式、提取容器等众多因素的影响，难以实现现代提取工艺与传统制法的质量一致性。质量标志物（quality marker，Q-Marker）最早于2016年由刘昌孝院士[7]提出，通过风险评估、试验设计等手段确定生产工艺的关键质量属性、关键物料属性与关键工艺参数间的关系模型，提高工艺稳健性和产品质量可控性[8-9]。基准关联度（standard relation，SR）可评价现代提取工艺下各样品与基准样品间质量的一致性，进而确定与传统工艺最接近的现代工艺。层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵权法可确定各个测定指标的权重系数，将主观赋权法和客观赋权法结合，实现主客观内在统一[10]，使筛选出的现代提取工艺参数更加科学可信。本研究基于质量源于设计（quality by design，QbD）理念，计算不同提取参数的各种评价指标下各样品与基准样品的基准关联度，结合AHP-熵权法对方中君臣佐使分别主观赋权，确定各评价指标的权重系数，以保证在所筛选的提取工艺参数下制备的样品与基准样品保持质量一致，确保提取工艺稳定可靠，为黄连汤的后续中试工艺和工业化生产提供科学依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Waters 2695型高效液相色谱仪，配备四元泵、柱温箱、自动进样器、2998检测器、Empower3色谱工作站，美国Waters公司；Milli-Q型超纯水机，美国Millipore公司；FA1104型电子分析天平，d＝0.1 mg，上海精密科学仪器有限公司；MS105DU型电子分析天平，d＝0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；AE-1106A型多功能红外炉，中山市爱米生活电器有限公司。
1.2 试药
对照品盐酸小檗碱（批号110713-201814，质量分数86.7%）、盐酸巴马汀（批号110732-201611，质量分数86.8%）、盐酸黄连碱（批号112026-201601，质量分数95.1%）、甘草苷（批号111610-201607，质量分数93.1%）、甘草酸铵（批号110731-201720，质量分数97.7%）、6-姜辣素（批号111833-201806，质量分数99.9%）均购自中国食品药品检定研究院。磷酸二氢钾，色谱级，上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈，色谱级，默克股份两合公司；甲醇，色谱级，江苏汉邦科技有限公司；磷酸，色谱级，上海阿拉丁生化科技有限公司；其他试剂为分析级。黄连（批号22041211）、干姜（批号22041811）、水炙甘草（批号22041311）、桂枝（批号22041511）、人参（批号22041711）、汤洗半夏（批号22042011）、大枣（批号22041711）均由神威药业集团有限公司提供，均经过南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，黄连为毛茛科黄连属植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎、干姜为姜科姜属植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎、水炙甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎、桂枝为樟科樟属植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝、人参为五加科人参属植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根茎、汤洗半夏为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternata Breit.的干燥块茎、大枣为鼠李科枣属植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实，均符合《中国药典》2020年版[11]饮片标准。
2 方法与结果
2.1 基准样品的制备
对黄连汤煎煮工艺进行研究，确定最佳工艺：称取黄连41.40 g，甘草（水炙）41.40 g，干姜41.40 g，桂枝41.40 g，人参27.60 g，半夏（汤洗）60.00 g，大枣42.00 g于砂锅中，加2000 mL水，浸泡60 min，以武火（2200 W）煮沸后，调节火力至文火（900 W）保持微沸，煎煮约60 min后，趁热滤过，滤液放凉后加水调整体积至1200 mL，即得黄连汤基准样品。
2.2 干膏率的测定
精密量取黄连汤基准样品10 mL于恒定质量后的蒸发皿中，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，记录质量，计算干膏率。
干膏率＝m/M
m为黄连汤汤干膏粉的质量，M为全方饮片质量
2.3 指纹图谱的测定[16]
2.3.1 色谱条件 Merck Purospher Star LP RP-18 endcapped色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（含0.05 mol/L磷酸二氢钾，磷酸调节pH 3.0）；梯度洗脱：0～7 min，10%～22%乙腈；7～19 min，22%～23.5%乙腈；19～28 min，23.5%～24%乙腈；28～42 min，24%～35%乙腈；42～52 min，35%～63%乙腈；52～54 min，63%～10%乙腈；54～56 min，10%乙腈；体积流量1 mL/min；检测波长280 nm；柱温25 ℃；进样体积10 μL。
2.3.2 方法学考察[16] 参考本课题组前期研究基础进行，结果均满足分析要求。
2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取黄连汤基准样品及正交水提液2 mL置10 mL量瓶中，加入甲醇7 mL，再加水至刻度，使甲醇体积分数为70%，称定质量，超声处理30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3.4 指纹图谱的建立及其相似度分析 分别取“2.3.3”项下方法制得基准样品供试品溶液及正交水提液供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样，测定指纹图谱。将色谱结果以cdf.的格式导入2012年版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行评价。以基准样品的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1 s，采用中位数法，进行全谱峰匹配，计算相似度。图谱见图1。
2.4 指标成分的含量测定[17]
2.4.1 色谱条件 检测波长237、280、345 nm，色谱柱等其余条件与“2.3.1”项下一致。典型色谱图见图2。
2.4.2 方法学考察[17] 参考本课题组前期研究基础进行，结果均满足分析要求。
2.4.3 对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量，加入甲醇配制成分别含盐酸小檗碱483.92 μg/mL、盐酸黄连碱103.83 μg/mL、盐酸巴马汀124.66 μg/mL、甘草苷292.80 μg/mL、甘草酸单铵盐493.61 μg/mL、6-姜辣素58.98 μg/mL的混合对照品溶液。
2.4.4 供试品溶液的制备 同“2.3.3”项下供试品溶液的制备方法。
2.5 黄连汤基准样品干膏率及指标成分的测定
取制得的基准样品，按“2.2”～“2.4”项下方法，平行制备2份供试品溶液，测定黄连汤基准样品的干膏率及各指标成分含量，算取平均值。
2.6 单因素考察
2.6.1 加水量考察 依次称取处方量的饮片于5 L圆底烧瓶中，分别加入4、6、8、10、12倍处方量的去离子水进行回流提取，分别浸泡60 min，提取60 min。按“2.3.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，结果见表1。随着加水量增加，黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸含量及干膏率呈上升趋势，超过10倍水后，6-姜辣素含量下降。结合随性物质基准考察指标，加水量的低水平及高水平分别为6倍量水和10倍量水。
2.6.2 浸泡时间考察 依次称取处方量的饮片于5 L圆底烧瓶中，加入8倍处方量的去离子水进行回流提取，分别浸泡20、40、60、80 min，提取60 min。按“2.3.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，结果见表2。随着浸泡时间增加，黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素的含量呈缓慢上升趋势，超过60 min后，甘草苷、甘草酸含量略有下降，干膏率无明显变化。因此，浸泡时间的低水平及高水平分别为20、60 min。
2.6.3 提取时间考察 依次称取处方量的饮片于5 L圆底烧瓶中，加入8倍处方量的去离子水进行回流提取，浸泡60 min，分别提取30、40、50、60 min。按“2.3.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，结果见表3。随着提取时间增加，黄连碱、巴马汀、小檗碱的含量和干膏率呈上升趋势，6-姜辣素的含量无明显趋势，提取时间超过50 min后，甘草苷上升缓慢且甘草酸含量下降。结合物质基准的各项指标，由此确定提取时间的低水平及高水平分别为30、60 min。
2.7 提取正交试验
（1）关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）和关键工艺参数（critical process parameters，CPPs）的确定：基于前期研究，物质基准初步预测黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸、桂皮醛、6-姜辣素为黄连汤潜在的质量标志物（Q-Marker）[16]。由于桂皮醛在制剂中的浓缩、干燥阶段损耗较大，故先提取桂枝挥发油，后用β-环糊精进行包合，在制粒环节加入颗粒中。因此，在提取正交试验中，选择6个指标成分含量（黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素）、干膏率及指纹图谱相似度作为黄连汤提取工艺的CQAs。结合文献分析，选择料液比（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）3个因素作为黄连汤制剂工艺的CPPs。
（2）正交试验设计：称取与传统工艺相同处方量的同一批的药材饮片，共9份，以料液比（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）3个因素为考察对象，以提取物中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度以及干膏率为评价指标，按L9(34)正交表进行提取，检测结果见表4。
2.8 基准关联度的原理方法
2.8.1 评价对象的确定 基准关联度是评价某样品与基准样品的相似度的关键参数，应首先确定样品评价的指标数目n和样品数目m，本方法的基本路线如图3所示。本研究将正交试验设计生成的9个样品与基准样品相比，以提取物中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度以及干膏率为评价指标，以Xi,j、Sj为评价对象，Xi,j表示正交试验的第i（i＝1，2，…，m）个样本的第j（j＝1，2，…，n）个指标下的测量值，Sj表示基准样品的第j（j＝1，2，…，n）个指标下的测量值。
2.8.2 相对偏差（relative deviation，RDij）值的计算 RDij表示第i（i＝1，2，…，m）个样本的第j（j＝1，2，…，n）个指标下的RDij，RDij越小则表明代
表Xij相对于Sj的偏差越小，即该条件下制得样品质量与基准样品相似度更高。根据公式（1）计算RDij。
RDij＝|Xi－Sj|/Sj （1）
2.8.3 基准关联度（standard relation，SRij）的计算 以基准样品质量为标准值（S），以正交试验设计下的各样品质量为测得值（X），以不同的指标为评价指标，按公式（2）计算所得结果，称为基准关联度，结果见表5。SRij表示第i（i＝1，2，…，m）个样本的第j（j＝1，2，…，n）个指标下的基准关联度。SRij越接近100%，在该指标下的工艺参数制得的样品与基准样品相似度越高。
SRij＝1－RDij＝1－|Xij－Sj|/Sj （2）
计算公式如公式（2）所示，计算结果表明，当以黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸为评价指标时，与基准样品最为接近的是试验8；当以6-姜辣素为评价指标时，与物质基准最为接近的是试验9；当以指纹图谱相似度为评价指标时，与物质基准最为接近的是试验6；当以干膏率为评价指标时，与物质基准最为接近的是试验1。由此可得，当以单一因素为评价指标时，试验所得最优结果会根据评价指标的变化而变化，因此需进行综合评分后才能确定提取工艺参数。
2.9 AHP-熵权法组合权重的计算
2.9.1 AHP主观赋权
（1）构建判断矩阵：根据君臣佐使原则[12]，黄连汤方中黄连和干姜为君药，黄连苦寒，清胸中之热、兼和胃气，干姜辛温，以温胃中之寒；臣药为桂枝和半夏，桂枝辛散温通、祛寒止痛，半夏和胃降逆止呕，宽胸散结消痞；佐药为人参和大枣，兼得益气健脾、缓和药性之效；使药为甘草，甘草甘平，缓腹中之痛[13]。诸药合用，可平调寒热、和胃降逆。
本研究参考《中药新药质量标准研究技术指导原则（试行）》要求[14]，根据黄连汤的处方组成，结合各味药中指标性成分的实际测得性和稳定性，选择君药黄连中的黄连碱、巴马汀、小檗碱，君药干姜中的6-姜辣素，以及使药甘草中的甘草苷、甘草酸为6个指标性成分，同时兼顾干膏率和指纹图谱。通过干膏率反映提取工艺的稳定性，指纹图谱体现制剂过程中小分子成分的轮廓及定性特征。
指纹图谱可反映小分子成分轮廓和定性特质，但与含量测定的指标性成分相比，其所包含的质量信息仍较少[15]，故将其重要程度视为与干膏率同等重要。故按黄连碱＝巴马汀=小檗碱＞6-姜辣素＞甘草苷＝甘草酸＞指纹图谱相似度≈干膏率的顺序，再根据AHP理论判断矩阵1～9标度，对同一层次内n个指标的相对重要程度进行打分，结果见表6。黄连碱、巴马汀、小檗碱为君药黄连的主要药效成分，相对于6-姜辣素较明显重要，故标为4，相对于甘草苷、甘草酸明显重要，故标为5，相对于指纹图谱相似度和干膏率明显更为重要，标为6，以此类推，根据公式（3）构建判断矩阵A，数据见表7，用aef表示因素e相对于因素f的比较结果。
（2）计算主观权重系数（WjS）：首先对判断矩阵A进行几何平均（方根法），按公式（4）计算得到初始权重系数（Wj′），ajn表示第j（j＝1，2，…，n）个指标因素对第n（n＝1，2，…，j）个指标因素的比较结果，然后按照公式（5）计算归一化WjS，得到5个指标的WjS，结果见表8。
（3）一致性检验：对矩阵进行一致性检验。首先根据公式（6）计算最大特征根（λmax），再根据公式（7）计算一致性指标（consistency index，CI），得到CI为0.03，一致性比例（consistency ratio，CR）（CR＝CI/RI，RI为自由度指标）为0.02，均小于0.1，表明该矩阵具有一致性[10]。
2.9.2 信息熵客观赋权
（1）建立正交试验原始数据矩阵：现有m个样本，n个评价指标，原始数据矩阵R＝(Xi,j)m×n，以黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度及干膏率8个指标为评价指标，建立原始数据矩阵（R）。
（2）将原始数据转化为概率矩阵：根据公式（8）将原始数据矩阵R转化为概率矩阵（P），Pij表示在第j个指标下第i个样本的概率。
（3）计算各指标的信息熵（Hj）和客观权重系数（WjO）：Hj越小，代表j指标下的数据离散程度越高，则其所提供的信息量就越大[10]。根据公式（9）计算出各指标的Hj依次为0.996 1、0.996 9、0.996 4、0.998 3、0.997 0、0.996 4、0.999 9、0.998 2，按照公式（10）计算各指标的WjO。
2.9.3 综合权重系数（Wj）的确定 采用AHP得到WjS，熵权法得到WjO，根据公式（11）计算各指标的Wj，结果见表8。
2.10 综合评分
通过AHP-熵权法得到的Wj，可知黄连碱占比30%，巴马汀占比24%，小檗碱占比28%，6-姜辣素占比5%，甘草苷占比5%，甘草酸占比6%，干膏率占比2%。根据公式（12）计算综合评分，结果见表4。由表4中结果可知，试验8综合评分最高，结果表示与古法最相似的现代工艺参数为A3B1C2，即以6倍量的水浸泡1 h煎煮45 min得到的样品与基准样品的质量最为一致。
综合评分＝SRi,黄连碱×30%＋SRi,巴马汀×24%＋SRi,小檗碱×28%＋SRi,6-姜辣素×5%＋SRi,甘草苷×5%＋SRi,甘草酸×6%＋ SRi,干膏率×2% （12）
2.11 验证试验
对优化后的提取工艺参数进行验证，重复试验3次，测定黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱相似度及干膏率，计算综合评分，结果见表9。验证试验的综合评分均值为90.11，与基准样品质量接近，且符合《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》[6]中对制剂生产研究的要求。综合评分的RSD值为1.09%，说明该方法确定的提取工艺稳定可靠且重复性良好。
3讨论
黄连汤作为平调寒热、和胃降逆治法的代表方，自古至今一直被众多医家广泛使用，对其进行经典名方制剂的开发研究意义重大。课题组前期已根据古籍记载制备了黄连汤标准汤液，并建立了其质量标准[16-17]。本研究基于QbD理念，选用正交试验设计，建立以黄连碱、巴马汀、小檗碱、6-姜辣素、甘草苷、甘草酸、指纹图谱相似度和干膏率为主的质量控制体系，确定以加水倍量、浸泡时间、提取时间作为关键工艺参数，采用单因素实验确定各因素水平，应用正交设计优化经典名方黄连汤的提取工艺。AHP作为主观赋权法，由人为确定各个评价指标的权重系数，受人为影响较大；熵权法作为客观赋权法，根据数据变化规律得出最终权重系数，但不能体现中药复方的君臣佐使关系。
本研究结合基准关联度和AHP-熵权法对质量评价体系进行赋权，明确8个指标在质量控制体系中的权重系数，以此优化黄连汤现代提取工艺为加6倍量水、浸泡60 min、提取45 min。所得工艺可保证工业生产的可行性及产品质量的稳定性，符合经典名方“传承精华、古为今用、古今衔接”的基本研究原则，实现了传统工艺向现代工业生产的关键一步。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：王晓丽，沈哲苑，李丽萍，梅 茜，何天雨，赵晓莉，毛 靖，侯金才，郭 勇，毛春芹，崔恩忠，陆兔林．基于正交试验结合基准关联度和AHP-熵权法优化经典名方黄连汤提取工艺 [J]. 中草药, 2023, 54(15):4804-4811.
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