研究背景：
基因表达失调是许多病理过程的根本原因。基因表达调控的大部分发生在转录水平，由一类主要蛋白质——RNA结合蛋白（RBPs）控制。RBPs能够识别RNA上的特定基序，使它们能够同时调控数百个转录本的命运。因此，RBPs是基因表达的主要调度者，也是极具前景的治疗靶点。目前正在进行的几项试验将RBPs作为治疗癌症的选择之一。例如，通过小干扰RNA（siRNA）抑制RBP HuR在肺癌中显示出有希望的结果，可以降低细胞活力和浸润。
由于对转录组数据、生物信息学工具和计算能力的获取有限，RBP的功能通常只研究了其中少数目标。然而，要充分发挥RBPs的治疗潜力，有必要超越个体目标，全面了解RBPs在整个转录组水平上的功能。计算生物学的最新进展现在使研究能够在健康和疾病中获得对RBP功能的详细认识。在这里，研究结合了生物信息学和实验方法来研究肺动脉高压（PAH）中RBP的功能。
患有PAH的患者通常年轻，生活质量较差，尽管接受当前治疗，寿命也较短。PAH表现为肺动脉压力的慢性增加，导致右心室肥厚，最终导致右心室功能衰竭和患者死亡。肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的增殖和抗凋亡表型是驱动肺动脉压力增加的原因。最近的科学进展将这些表型与PAH-PASMC中基因表达的全基因组失调联系起来。RBPs能够同时调控数百个RNA的命运，因此在PAH中具有很高的治疗潜力。然而，目前在PAH中还没有进行关于RBPs作用的全转录组研究。本研究重点关注一个特定的RBP功能，即异质核糖核蛋白HNRNPA2B1（异质核糖核蛋白A2B1；A2B1）。已知A2B1促进癌细胞的增殖和抗凋亡表型，并且已显示其促进动脉粥样硬化平滑肌细胞的增殖。由于增殖是PAH-PASMC的关键病理表型，将重点研究A2B1在PAH中的作用。
在本研究中，展示了A2B1在PAH-PASMC中的上调表达。研究还表明A2B1在PAH-PASMC中的细胞核定位增加。通过生物信息学分析，研究识别了A2B1的3个已知基序及携带这些基序的所有人类mRNA。研究表明，所有这些基序调控着参与细胞周期的基因。此外，通过PAH-PASMC的RNA测序（RNA-seq），研究证明A2B1促进其目标基因的表达。在PAH-PASMC中抑制A2B1导致了携带A2B1基序的所有测试mRNA的下降，以及增殖和抗凋亡的减少。最后，在大鼠的MCT诱导的肺动脉高压（PH）模型中抑制A2B1可挽救肺动脉高压。
研究方法：
通过计算生物学和实验生物学的整合，作者研究了A2B1在人类PAH-PASMC中的作用。生物信息学和RNA测序使他们能够全面调查A2B1的转录组功能，RNA免疫沉淀和A2B1沉默实验使他们能够解析其中复杂的分子机制。此外，他们在MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型中进行了临床前试验，以研究A2B1抑制在缓解肺动脉高压严重程度方面的相关性。
研究结果：
他们发现A2B1的表达及其在细胞核内的定位在人类PAH-PASMC中增加。
图1.A2B1的表达在PAH-PASMCs中上调。
A2B1通过识别RNA上的一个或多个特定基序发挥其功能。已知的A2B1基序可以在ATtRACT数据库中找到引用。研究使用这些已知的A2B1基序在5'UTR、CDS和3'UTR序列数据库中识别携带它们的所有人类mRNA（图2A）。我们确定了3个基序具有足够的序列复杂性，可以通过FIMO算法进行统计检测（图2B）。这些基序分别为CUAGACUAGA、UAA[CG]UUAU和GCC[GC]AAG[GA][AG][GA]CC（图2B）。为了方便阅读，在图中我们用颜色来表示它们：黄色表示CUAGACUAGA，蓝色表示UAA[CG]UUAU，红色表示GCC[GC]AAG[GA][AG][GA]CC。此外，我们还确定了这些基序在每个mRNA上的位置（5'UTR、CDS或3'UTR），因为每个不同的位置更容易调控不同的功能。例如，一般来说，3'UTR中的基序调控mRNA的稳定性和翻译。我们所识别的3个A2B1识别基序在mRNA的3'UTR中较为常见（图2B），这表明它们在调控mRNA的稳定性和翻译中可能起着重要作用。
我们预测了3个独立的A2B1基序具有互补且不冗余的功能，因为我们假设A2B1通过识别多个基序来实现特定的功能。这促使我们研究了这3个基序在PAH-PASMCs中的作用。我们通过在线可获得的RNA测序数据识别了所有携带每个独立基序的PAH-PASMCs中差异表达的基因（图2C）。
基因表达调控是一个高度复杂的过程，涉及多个调控水平的协调。因此，我们必须考虑到，根据细胞类型和代谢状态，携带A2B1基序的mRNA可能并不总是在其调控之下。为了确定在PAH-PASMCs中具有最高概率受到A2B1调控的mRNA，我们将PAH中所有携带A2B1基序的差异表达基因与A2B1自身的表达进行了相关分析（图2D）。这种相关性分析显示，在PAH中，约30%的携带A2B1基序的差异表达mRNA与A2B1自身的表达呈现正相关（R>0.7或R<–0.7）。其中绝大多数相关的mRNA与A2B1表达呈正相关，这表明在PAH-PASMCs中，A2B1促进了受其调控的mRNA的表达。
图2. A2B1通过促进其目标基因在PAH-PASMCs中的表达来调控细胞周期。
接下来，研究旨在通过研究A2B1的每个基序来探究其在PAH中的功能。对于3个已识别的基序，我们使用与A2B1表达呈正相关的PAH-PASMCs中差异表达基因，并对其进行本体富集统计（图2E）。富集的本体大多与细胞周期相关。然而，在大多数情况下，每个特定的本体都与其中一个基序相关。这支持了A2B1在PAH-PASMCs中通过控制各个机制来调控细胞周期的观点，每个机制由不同的A2B1基序调控。这些数据支持了我们先前的假设，即3个A2B1基序在PAH-PASMCs中具有互补且几乎不冗余的功能。
为了进一步了解每个单独的A2B1基序及其携带它们的mRNA在PAH-PASMCs中的作用，我们使用KEGG途径将这些PAH-PASMCs的mRNA映射到已知的途径上（图3）。这个KEGG途径映射确认了3个A2B1基序在细胞周期调控中的功能，并展示了每个基序作用的更详细的
。红色基序在调控G1/S检查点、DNA合成检查点和纺锤体装配检查点的调节中起着重要作用（图3A）。蓝色基序在调控G2/M检查点中起作用，并在调控G1/S和纺锤体装配检查点方面作用较小（图3A），黄色基序参与调控DNA聚合酶复合体（图3B和3C）。综合而言，所有3个基序在细胞周期调控的特定方面的参与，暗示A2B1是在PAH-PASMCs中未被认识的主要调度者，调控增殖和抗凋亡表型。
图3. 每个A2B1 RNA识别基序调控细胞周期的独特方面。
为了验证我们的生信结果并研究A2B1在体外的作用，我们选择了每个基序的代表性mRNA靶标，以展示A2B1在细胞周期调控中的不同方面作用。对于黄色基序，我们使用RNA聚合酶II亚单位D（POLR2D），它是RNA聚合酶II的一部分（图4A）。对于蓝色基序，我们使用AURKA（极化激酶A），它与纺锤体装配检查点有关（图4B）。对于红色基序，我们使用MCM6（mini chromosome maintenance 6），它是螺旋酶复合物的一部分（图4C）。我们使用RNA测序和实时定量聚合酶链反应数据确认了每个代表性靶标与A2B1的正相关性（图4A到4C，左图）。在原代培养的人类PAH-PASMCs中，所有选择的靶标独立于它们携带的A2B1基序而上调（图4，中间图）。我们的RNA免疫沉淀实验进一步确认了A2B1与这些代表性mRNA的直接结合（图4，右图）。随着A2B1靶标的上调，与对照组PASMCs相比，PAH-PASMCs显示出增殖（图4D）和抗凋亡表型（图4E）。
图4. 对我们在原代培养的PAH-PASMCs上进行的生物信息学发现的实验验证。
为了确认A2B1在上调其靶标和在PAH-PASMC的增殖和抗凋亡表型中的作用，我们在PAH-PASMCs中沉默了A2B1表达（siA2B1）并进行了RNA测序。与对照组相比，我们确认了siA2B1处理的PAH-PASMCs中A2B1 mRNA和蛋白表达的显著下调（图5A和5B）。我们还证明了核异构体B1在siA2B1处理的PAH-PASMCs中也下调（图5A，左图）。使用Gene Set Enrichment Analysis软件，我们对RNA测序数据进行了分析，寻找A2B1基因集（每个基序一个）的下调以及A2B1调控的途径的下调。我们发现，作为一组，A2B1的靶标和我们发现受A2B1调控的途径（有丝分裂细胞周期阶段转换、细胞周期、G1/S转换和G2/M转换；图2）在PAH-PASMCs中都被A2B1沉默所下调（图5C）。我们通过实验证实了这些生物信息学的结果，因为A2B1沉默导致所有测试的代表性靶标的表达显著下降，无论它们携带的基序是哪一个（图5D）。与细胞周期相关的mRNA表达减少相一致，与Si-Scrm相比，siA2B1处理的PAH-PASMCs增殖减少，而对凋亡的敏感性增加（图5E和5F）。综合而言，这些数据确认了我们的生物信息学结果，即A2B1在PAH-PASMCs中正向调控其靶标的表达，从而调控PAH-PASMCs的增殖/抗凋亡表型。
图5. A2B1沉默下调其预测的目标基因，并恢复PAH-PASMCs的增殖和抗凋亡失衡。
为了评估A2B1在PH中的治疗相关性，我们在MCT诱导的PH大鼠的肺部抑制了A2B1的表达（图6A）。从MCT注射后的第14天到第28天，MCT大鼠接受了6次对靶向A2B1的siRNA（siA2B1）或随机对照（Si-Scrm）的气管内滴注。
每周超声心动图显示，在MCT处理的大鼠中，与对照组相比，MCT注射后的第14天肺动脉加速时间显著减少，同时心脏右室壁厚度增加（图6B和6C）。然后，从第14天到第28天，我们观察到MCT+siA2B1大鼠的肺动脉加速时间和右室壁厚度稳定，而这些参数在MCT+Si-Scrm大鼠中进一步恶化（图6B和6C）。在第28天，MCT+Si-Scrm处理的大鼠右室壁厚度低于第3周，表明右室失代偿的启动（图6C）。此外，MCT+Si-Scrm处理的大鼠的主动脉开始扩张，在第21天开始显现，并在第28天与对照组和MCT+siA2B1处理的大鼠相比显著增加（图6D）。
在实验方案结束时，右心导管揭示MCT+siA2B1大鼠的右室收缩压显著低于MCT+Si-Scrm大鼠（图6E）。右室肥厚和肺重量的测量表明，与MCT+Si-Scrm大鼠相比，MCT+siA2B1大鼠的Fulton指数较低，肺重量较轻，表明MCT+siA2B1大鼠中PH较轻（图6F和6G）。
图6. 肺部A2B1抑制拯救了大鼠MCT诱导的肺动脉高压。
肺血管组织学评估显示，MCT+Si-Scrm大鼠的血管壁厚度增加（图7A），伴随着A2B1表达的上调（图7B）以及血管平滑肌细胞的增殖/抗凋亡表型，与对照组大鼠相比（图7C和7D）。此外，MCT+Si-Scrm大鼠的肺血管平滑肌细胞中的所有3个代表性靶标与对照组大鼠相比均显著增加（图7E到7G）。引人注目的是，与Si-Scrm大鼠相比，MCT+siA2B1大鼠的血管壁厚度较薄（图7A），伴随着A2B1表达的下调（图7B），增殖率的降低（图7C），对凋亡的抵抗（图7D），以及所有测试的A2B1靶标的表达的减少（图7E到7G）。数据表明，A2B1的抑制通过调控其靶标，改善了MCT大鼠中PASMC的增殖/抗凋亡失衡。
图7. 肺部A2B1的抑制逆转了血管重塑和平滑肌细胞的增殖/抗凋亡表型。
研究结论：
通过计算生物学和实验生物学的应用，该研究揭示了A2B1作为PAH-PASMC表型的主要调度者的角色，并证实其作为PAH治疗靶点的相关性。总之，本研究首次整合了计算生物学和实验生物学，绘制了一个全面的
，揭示了1个RNA结合蛋白A2B1在PAH中的作用。这一展示推动了我们对RNA结合功能的理解。此外，我们还展示了A2B1在PAH中是一个有前景的治疗靶点，为这种致命疾病开辟了新的治疗途径。
有什么新进展？
作者开发了一种2步计算方法，用于确定RNA结合蛋白的所有可能靶标，以便在与疾病相关的背景下探索其功能。这是首次将计算方法和实验工具相结合，全面描绘了RNA结合蛋白HNRNPA2B1（异质核糖核蛋白A2B1）在人类肺动脉高压样本的临床相关框架中的功能。本研究的方法显示了HNRNPA2B1在肺动脉高压-肺动脉平滑肌细胞表型中的主要调控作用。
临床意义是什么？
在严重肺动脉高压的临床前模型中抑制HNRNPA2B1可以缓解肺动脉高压，证明RNA结合蛋白抑制在治疗肺动脉高压方面的相关性。研究结合了计算方法和实验方法，这种方法的适用性广泛，可以在不同生物学环境中使用，为更好地理解RNA结合功能及其在肺动脉高压和其他多种疾病治疗中的应用铺平道路。
参考文献：
Ruffenach G, Medzikovic L, Aryan L, Li M, Eghbali M. HNRNPA2B1: RNA-Binding Protein That Orchestrates Smooth Muscle Cell Phenotype in Pulmonary Arterial Hypertension. Circulation. 2022 Oct 18;146(16):1243-1258. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.122.059591. Epub 2022 Aug 22. PMID: 35993245; PMCID: PMC9588778.
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