PBJ | 六倍体龙葵基因组解析并利用同源基因饱和编辑对数量性状进行精准改良提升抗病性和增加果实产量

多倍体在开花植物中很常见，可以促进植物物种形成。许多主粮作物表现为多倍体，难以进行基因改造，基因组测序和编辑的最新进展使多倍体基因组工程成为可能。由于多倍体基因组的大小和重复序列的存在，多倍体基因组的测序和组装仍然具有挑战性。利用CRISPR -Cas9系统，我们可以进行靶向诱变，这也有助于多倍体的基因组工程。天然存在的六倍体黑色龙葵属于龙葵科，其果实含有有益的代谢物，作为人体保健品具有很大的潜力。为了改良作物而设计多倍体基因组，必须获得基因组信息。但六倍体黑龙葵的全基因组以前没有报道。

近日，国际著名杂志Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid”的研究文章，作者通过对同源基因的比较分析，确定了具有相似序列和表达谱的同源基因集，这些同源基因集与二倍体近亲少花龙葵(Solanum americum)和番茄(S. lycopersicum)相似。并利用CRISPR- Cas9介导的靶向精准编辑技术在同源基因中产生了多种突变组合,多个突变体表现出基于基因型的数量表型变化，对六倍体黑穗病的数量性状产生广谱影响。此外，作者成功地提高了一个孤儿品种Boranong的果实产量，这表明编辑同源基因可以用于多倍体作物的农业改良，为多倍体作物的工程育种提供了一条广阔的应用途径。

该研究通过对六倍体黑龙葵和二倍体的美洲少花龙葵两个物种进行杂交并且根据茄科植物的叶绿体cDNA序列构建了系统发育树，并且通过Oligo-FisH(荧光原位杂交)对这两个物种的染色体组成进行分析计算，得出六倍体黑龙葵可能是从其二倍体少花龙葵进化而来的（图1），并结合从头预测、ESTs、转录本和蛋白质比对获得六倍体龙葵的基因组信息，对六倍体黑棘豆进行基因组测序、组装和功能注释。作者通过比较茄科植物基因组序列，结合前面的研究推测六倍体龙葵可能有大约三个同源基因与少花龙葵的基因同源，并研究了同源基因的表达模式是否保守，结果表明参与生长和发育的重要基因可能在功能上是保守的（图2）。

作者使用4个sgRNA靶向S、SP、CLV3和CLE9四个基因进行了CRISPR - Cas9介导的突变，并在T0转基因群体中观察到在六倍体中比二倍体具有更多的突变（图3）。数据表明多倍体植物比二倍体植物具有更好的补偿机制，因为多倍体植物具有更多的功能保守的同源基因拷贝数。作者通过互补分析证实了龙葵中三联体存在的同源基因中的S或SP基因都可以完全恢复敲除突变体的表型。因此，我们可以利用多倍体作物的遗传冗余来建立具有理想农业性状的遗传优化植物。

为了产生一系列具有不同数量功能同源基因的突变体，作者将crispr - cas9介导的敲除突变体与野生型回交，通过编辑S同源基因和筛选具有不同功能拷贝数的基因型，精确地生成了产量优化的龙葵自交系。作者使用CRISPR-Cas9系统在六倍体龙葵和少花龙葵中产生了多种SP突变体，证实了SP基因的功能保存，产生的表型不是等位基因特异性的。作者观察到突变体中一种与其他二倍体物种不同的生长表型（图4），节间长度缩短，腋芽伸长受到抑制，腋芽密集形成花序束，将这种生长模式定义为半不确定(SID)型。SID表型果实产量与WT相比大多增加，在sp1/+sp2sp3和sp1sp2/+sp3基因型中产量最大。研究得出结论，SP突变也可能对六倍体黑麦植株致密性产生剂量效应，通过筛选不同的基因型，可以获得产量最大化的植株。研究表明我们可以通过调节功能CLV3和CLE9基因来优化果实大小（图5），与同源补偿相关的工程同源基因可以产生一系列可以在多倍体生物中优化的数量性状，该研究利用基因编辑技术提高了Boranong的果实产量（图6）。

在这项研究中，我们将六倍体黑葡萄与其二倍体亲缘种少花龙葵和番茄进行了比较，确定了同源基因，组装了六倍体龙葵的基因组。使用CRISPR-Cas9系统生成了一系列具有不同分子剂量靶基因的突变体，通过对突变体的表型分析，从六倍体龙葵中分离出了产量最大的植株。此外，作者将策略应用于孤儿品种Boranong，并成功地生产出了果实产量显著提高的基因改良植株。尽管六倍体龙葵基因组仍处于支架水平，每条染色体的起源尚未确定，但能够定义和编辑同源基因来调节农业性状。因此，该方法可能对其他基因组信息尚未建立的多倍体作物品种的工程设计有用。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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