基因编辑 | 上海科技大学季泉江/西湖大学申怀宗开发出新的微型高效的基因组编辑器

CRISPR-Cas12f核酸酶能够通过货物大小有限的载体有效地递送，从而显示出在体内治疗应用的前景。Acidibacillus sulfuroxidans Cas12f1 (AsCas12f1, 422个氨基酸)是最小的Cas12f核酸酶之一，与Cas9和Cas12a相比，在人类细胞中表现出中等的基因组编辑活性。了解为什么这种紧凑的核酸酶对基因组编辑有活性的机制将有助于其合理的工程设计。

2023年7月31日，上海科技大学季泉江和西湖大学申怀宗团队合作在Nature Catalysis（IF=38）在线发表了题为“Structure and engineering of miniature Acidibacillus sulfuroxidans Cas12f1”的研究论文，该研究展示了AsCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合物的冷冻电镜结构，并揭示了AsCas12f1作为sgRNA结合和DNA靶向的不对称二聚体的功能。

该研究阐明了二聚体形成、原间隔基序识别和sgRNA调节的机制。基于这些发现，该研究对该系统进行了广泛的工程设计，并在人类细胞中产生了一种进化的AsCas12f1-sgRNA组合，其基因组编辑活性大大增强。这些结果提供了对小型CRISPR系统的进一步理解，并扩展了用于治疗应用的迷你CRISPR工具箱。

CRISPR和Cas系统为原核生物和一些巨大的噬菌体提供了抗侵入性核酸的适应性免疫。CRISPR-Cas系统的遗传组成和功能配置多种多样，目前分为两大类(1类和2类)和六大类(I-VI类)。2类系统，包括II型、V型和VI型，以RNA引导的单多域效应核酸酶为特征，如Cas9、Cas12和Cas13，并已被设计成突破性的基因组编辑工具。其中，Cas9和部分Cas12核酸酶诱导基因组DNA的双链断裂(DSBs)，通过非同源末端连接(NHEJ)机制导致插入和删除(indel)突变，或通过补充修复模板的同源直接修复(HDR)进行精确的遗传修饰。与脱氨酶的融合产生碱基编辑器，以单碱基对的精度改变DNA，与逆转录酶的结合产生先导编辑器，允许引入任何预先确定的短插入、删除和突变类型。这些技术极大地促进了各种生物体的基因工程，并为治疗遗传疾病、癌症和传染病提供了新的治疗选择。

然而，最常用的Cas9和Cas12a核酸酶的分子大小很大(大多数大于1000个氨基酸)，这给有效的细胞递送带来了困难，特别是在使用诸如腺相关病毒(AAV)等货物大小有限的递送载体的情况下。最近的研究发现了一组能够靶向dsDNA的小型CRISPR核酸酶，包括Cas12e(也称为CasX，~ 1000 a.a)、Cas12f(以前称为Cas14, 400-700 a.a)、Cas12i (~1000 a.a)、Cas12j(或CasΦ，700-800 a.a)、Cas12l(或Casπ，~860 a.a)、Casλ (~800 a.a)、TnpB (~400 a.a)和IscB (~400 a.a)。然而，它们中的大多数对于具有自然形态的哺乳动物细胞的基因组编辑要么不胜任，要么效率低下。通过结构导向工程，将其中一些基因转化为高效的基因组编辑器。

在这些紧凑的CRISPR核酸酶中，Cas12f目前似乎在基因组编辑效率和分子大小之间取得了完美的平衡。第一个鉴定出的Cas12f核酸酶Un1Cas12f1(也称为Cas14a1, 529a.a)来自未培养的古菌，最初发现它只针对ssDNA。后来，它被证实能够切割dsDNA。然而，自然形式的Un1Cas12f1在真核细胞中有限的内源性基因座上仅表现出可忽略不计的低活性。Un1Cas12f1-sgRNA-dsDNA复合物的冷冻电镜结构研究揭示了一种不对称的同型二聚体结构，用于结合sgRNA靶向dsDNA底物。

有趣的是，近一半的天然gRNA支架在结构上是柔性的。通过系统截断sgRNA中的柔性区，Un1Cas12f1在哺乳动物细胞中转化为高效且特异性的基因组编辑器。相比之下，Acidibacillus sulfurooxidans Cas12f1 (AsCas12f1, 422 a.a.)是一种天然活性的基因组编辑器，相对于广泛使用的SpCas9和AsCas12a，其indel活性水平适中。然而，在AsCas12f1的sgRNA对应物中，类似的截断部分或完全取消了其dsDNA切割活性。这些发现表明，尽管两种Cas12f1核酸酶序列相似(同源性约为26%，阳性约为45%)，但AsCas12f1可能通过其结构构型与Un1Cas12f1区分开来，使其具有更小分子尺寸的基因组编辑功能。

研究思路示意图。图自：Nature Catalysis

该研究报道了AsCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合物在2.7-Å分辨率下的冷冻电镜结构，揭示了不对称二聚化的AsCas12f1蛋白适应sgRNA和靶向dsDNA结构特征。通过与Un1Cas12f1的结构对比分析，揭示了该结构在二聚体界面、PAM识别区域和AsCas12f1 sgRNA内的几个独特结构特征，共同解释了AsCas12f1如此小的分子大小如何作为基因组编辑器发挥活性的关键机制。

接下来，通过结构引导工程对AsCas12f1核酸酶及其对应的sgRNA进行广泛优化，最终进化出基因组编辑器(AsCas12f1-v5.1 + sgRNA_T1)，其基因组编辑活性显著增强。这些发现为理解小尺寸CRISPR核酸酶的基本工作机制和分子进化奠定了基础，为提高基因组编辑器的性能提供了实用知识，并扩大了CRISPR基因组编辑工具箱用于治疗应用。

来源：iNature

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41929-023-00995-4

转自：“威斯腾生命科学研究院”微信公众号

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