Plant Cell | CRISPR/Cas9诱导的DNA断裂触发染色体丢失和染色体重排

植物育种是将亲本基因组中的理想特征进行组合的艺术。通常在减数分裂过程中通过交叉互换（crossover）来实现，即同源染色体间染色体片段的交换。目前尚无法精确定位减数分裂中的交叉互换断点。通过DNA双链断裂（DSB）可以刺激体细胞发生交叉互换，并且可以稳定遗传给下一代。在番茄（番茄科茄属）的特定果实颜色位点上已经证明了这一点，但需要一个更普遍的系统来成为精确育种的有用工具。

近日，以色列魏茨曼科学研究所植物与环境科学系Aviva在the Plant Cell上发表了一篇题为“CRISPR/Cas9-induced DNA breaks trigger crossover, chromosomal loss, and chromothripsis-like rearrangements”的研究论文。该研究设计了一种检测植物体细胞中杂合性丧失（LOH）的实验方法，以研究由Cas9核酸酶引起的广泛染色体变异，为精确育种提供了有力工具。

为了表征由双链断裂（DSB）引发的杂合性丧失（LOH）事件，并理解其潜在原因，作者开发了一个基于已知位置的显性遗传标记（称为Betalain [Bet]，产生甜菜碱色素）的系统，该标记存在于杂合背景中。在标记物和着丝粒之间的任何体细胞中诱导的DSB可以通过非同源末端连接修复（NHEJ），而不会产生表型果实，如果通过同源重组（HR）修复，则可能发生交叉互换，可以产生双子区域，即在浅紫色半合子（Bet/-）背景中，存在一个野生型（WT）无转基因颜色的区域（-/-）和一个转基因纯合的深紫色区域（Bet/Bet）。如果DSB未修复，LOH也可以通过失去表型标记来检测。

通过对DSB周围的基因分型进行确认：在端粒近侧，PSY1 gRNA位点和最接近PSY1 gRNA的SNP都是杂合的（M82/MT），而靠近着丝粒的下一个SNP是纯合的MT。该植株进行了全基因组测序分析，结果显示在DSB位点两侧的碱基没有发生变化。因此，这种由杂合型变为纯合型的改变不太可能是由于染色体片段的丢失造成的。在同一植株的其他果实的十个F2后代中，没有发现CO事件，也没有在M82 pX11 x MT SpCas9对照植株（缺乏PSY1 gRNA）的十个F2后代中发现CO事件。

对植株3-1、5-1、5-2、1-1、5-4、9-1以及Micro-Tom和M82进行了全基因组测序（WGS），植株3-1、5-1和5-2的测序覆盖度与亲本植株Micro-Tom和M82相似。9-1的全基因组测序结果显示，除了染色体11出现显著偏离外，其余基因组区域的覆盖度和SNP杂合性符合预期。染色体11的覆盖度为1倍，并且SNP只与M82亲本相对应，除了穿越着丝粒的读数可能受到比对偏差的影响。值得注意的是，只有含有Cas9和gRNA并诱导了DSB的植株中才检测到这种大规模的缺失，而对照植株中并未观察到类似现象。

对植株1-1和5-4的花粉母细胞进行了细胞学分析，发现在减数分裂第一后期存在桥连接，以及四分体中的微核。桥连接的检测进一步表明了全基因组测序中检测到的染色体重排的存在。这些重排可能是之前的BFBC事件的结果。微核的存在也与无着丝点染色体片段或无法正确配对的染色体一致，推测是由于其重排导致的。

CRISPR介导的DSB可以通过视觉手段检测到体细胞的交叉互换，为作物的精确育种提供了可能性。此外，展示了杂合性丧失可能是由于DSB的缺陷修复引发的重大染色体重排。发生这种情况的植物含有大片段的缺失和易位，并且无法繁殖。这种基因组重排类似于哺乳动物细胞中的染色体破碎重组。交叉互换和染色体破碎重组事件都很罕见，但通过视觉检测方法可以检测到。染色体修复导致了交叉互换以及染色体重组。新的检测方法还将有助于研究如何使有针对性的体细胞交叉互换在育种应用中更加高效。

原文链接：

https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koad209/7231994

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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