小麦和大麦是营养丰富且密切关系到人类健康，在世界各地广泛种植的两种重要谷物。病虫害对小麦产量降低约20%，谷物锈病(锈菌属)和霉病(蓝霉属)病原体具有高度的宿主特异性，与少数宿主物种共同进化。由小麦黑麦病(Pst)引起的条锈病和由小麦黑麦病(Pt)引起的叶锈病可导致易感品种损失高达50%。单一栽培和气候变化有利于出现新的高毒力病原体变种，从而降低产量，对全球粮食安全构成严重威胁。虽可通过杀菌剂进行防治，但其产生的选择压力易使病原体突变产生抗药性，且存在昂贵、环境不友好等缺陷。以往研究人员曾对病原物致病性和植物的免疫机制进行了大量研究。与传统抗性育种相关的方法挑战是在高产作物品种中部署抗性(R)基因的主要瓶颈。植物基因组、结构机制、生物信息学的创新和植物转化技术的进步，快速的基因分离、功能研究、合成抗性的定向工程和精确的基因组操作，缓解了这一瓶颈。大多数克隆的谷物R基因编码典型的免疫受体，这些受体本身很容易通过选择逃避抗性的致病菌株而被克服。越来越多的克隆R基因允许多基因堆叠，原则上，可提供更持久的抗性。新的基因组学方法提高了基因分离率，提高了我们对宿主抗病和病原体获得毒力的分子基础的理解。在感染小麦科谷物的生物营养性病原体的情况下，对每种各自病理系统的宿主-病原体遗传学的深入了解促进了这种分子洞察力。
近日澳大利亚拉筹伯大学动植物与土壤科学系拉筹伯农业与食品可持续研究所Peter M. Dracatos团队联合沙特阿拉伯图瓦尔阿卜杜拉国王科技大学生物与环境科学与工程系等多家单位研究人员近日在Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Resistance that stacks up: engineering rust and mildew disease control in the cereal crops wheat and barley”的综述。作者在这篇综述中讨论了小麦和大麦与引起锈病和白粉病的真菌相互作用的分子遗传分析的最新进展，还讨论了基因组学的发展如何带来新的育种和生物技术机会，以实现谷物锈病和白粉病的持久控制。
作者主要从以下8个方面展开讨论并进行了展望。
1.通过基因组学增强关联遗传学捕获功能多样性
参考基因组的可用性和基因类特异性捕获阵列的发展无疑增强了利用基于图谱的克隆技术克隆R基因的努力。此外，无偏复杂性简化法已应用于分离与抗病相关的基因和谷物的形态特征。基因组复杂性简化法的必要性正在下降，因为研究人员更多地利用快速下降的DNA测序成本来生成抗性植物的参考基因组或对GWAS的遗传多样性小组进行测序。挖掘种质资源以获取感兴趣的性状并将其引入作物育种计划远非新颖之举。该资源提供了对驯化大麦全球种群结构的深入了解，并通过增加标记密度和种群规模，提高了GWAS的分析能力。此外，对大麦基因库的不同亚群进行表型分析，确定了先前克隆的控制病毒抗性和形态性状的基因的标记-性状关联。这些方法有助于快速鉴定谷物作物对生物营养真菌病原体抗性的以前未表征的等位基因。
2.泛基因组学揭示了R位点的变异程度
分子通行证数据可用于选择适合测序和组装染色体尺度参考基因组的代表性基因型。面包小麦和大麦的泛基因组计划在微观和宏观尺度上揭示了种内结构变异的程度。泛基因组的可用性解决了基因克隆项目中最常见的瓶颈，即过度依赖于单个可用参考基因组中的基因顺序和表示。大麦和小麦泛基因组的用途在于能够利用最密切相关的基因型信息或直接从包含感兴趣性状的测序基因型中获得的信息作为参考基因组，从而限制单核苷酸多态性(snp)、存在/缺失变异和反转的数量。基因复制和多样化选择导致NLR在植物基因组中呈聚类分布。泛基因组变异，如PAVs，与NLR和其他类型的R基因特别相关。通常，调节抗性的NLR在易感基因中缺失或功能降低。小麦和大麦泛基因组的发布对于分离非典型R基因已经并将继续具有重要意义。最近，利用更新的大麦泛基因组，利用比较序列和表达分析克隆了抗性基因Rph7.Lr14a, Rph3和Rph7分别编码锚蛋白膜结合重复蛋白、推测的执行蛋白和NAC转录因子的研究。笔者还介绍了近些年有研究人员已将PacBio高保真长读取、光学定位和染色体构象捕获(HiC)相结合，生成了南非抗条锈病面包小麦cv的改进的14.7 gb染色体尺度组装。将之前报道的短读和PacBio长读测序技术的N50序列长度提高了150- 600倍，达到30 Mb。改进的基因组组装允许有效分离种族特异性R基因Yr27。综上所述，这些小麦和大麦泛基因组研究突出了加速R基因克隆和表征的机会。
3．NLR整合结构域揭示了ETI致病性靶点的多样性
NLR是一种免疫受体蛋白，通常包含三个结构域。中心核苷酸结合域是所有NLR共有的。大多数NLRs还具有C端富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域，该结构域赋予病原体识别特异性，以及参与信号传导和随后的细胞死亡的n端相互作用结构域。在单子叶植物(所有谷类植物)中，N端通常包含一个螺旋状结构域(CC)。最近的NLR基因克隆和功能研究揭示了多种非典型整合结构域(IDs)，它们充当病原体效应物的诱饵，并在与诱饵相互作用时触发特异性免疫反应。在某些情况下，NLR基因编码具有物种特异性或在不同谷物和作物物种中常见的ID组合的免疫受体蛋白。
4.宿主专化的各种“看门人”
由结构上不同的R基因类编码的蛋白在形成宿主特异性屏障中起关键作用。一个相关的例子是小麦，其中两个R基因Rwt3和Rwt4，分别编码NLR和串联激酶，作为宿主特异性屏障对抗非小麦瘟病型。来自栽培大麦和球茎大麦的同源细胞壁相关受体激酶基因分别赋予了对适应性和非适应性叶锈病病原体的部分和非宿主抗性。亲缘关系密切的谷物基因组内部和之间的R位点共享遗传结构通常具有不同的病原体特异性。然而，在某些情况下，nlr可能具有双重病原体识别特异性，赋予对适应病原体的种族特异性抗性和对适应密切相关宿主物种的病原体变体的抗性。例如，编码Mla8中LRR结构域的522 bp序列区域决定了识别大麦白粉病和小麦条锈病的双重特异性。Mla8代表了谷物基因组中对不同属的适应性和非适应性生物营养病原体具有抗性的共同遗传结构的一个显著例子，这表明该R基因与小麦条锈病的寄主物种特异性有关。大麦是适应条纹状假单胞菌菌株的宿主;然而，Mla8并没有对霍氏条纹状假单胞菌产生抗性。这两项研究强调了进一步分子表征和理解的重要性，以便能够在生物技术应用中操纵谷类作物的非寄主抗性性状。与此同时，利用病理基因组学了解生物营养病原体分离物对密切相关的宿主谷物特异性的分子特征，可能有助于预测未来的宿主跳跃。
5.利用克隆的识别效应基因来确定NLR基因的功能并预测其持久性
克隆广泛有效的个体特异性R基因对应的病原菌效应物对确定R基因的功能具有重要作用。效应物的发现落后于R基因的克隆，这是由于与专门的生物营养真菌病原体一起工作的挑战，以及由于在某些情况下控制毒性的意想不到的遗传复杂性，最近发现的两个控制小麦抗性基因Pm1a毒力的病原体位点证明了这一点。然而，展望未来，大量克隆的R基因结合开发瞬时表达系统的最新进展和针对目标R基因的毒力获得突变文库的开发，如最近应用于小麦锈病将通过允许快速功能分析来研究其特异性，从而促进效应生物学研究。Avr基因克隆研究也可以通过改进的硅锈效应预测工具来增强和/或提高效率，以减少用于功能验证的候选效应的数量。病原群体中毒性丧失导致抗锈病能力下降的一个机制是锈病病原基因组中转座因子的增殖和动员。此外，最近的一项研究通过在T. aestivum原生质体和Nicotiana benthamiana叶片中进行细胞死亡实验，确定了Sr50的LRR区域中负责AvrSr50效应物识别和特异性的关键残基。这些作者从Tausch的山羊草中设计了Sr33，其在蛋白质水平上与Sr50有80%的相似性，以识别AvrSr50。这些研究是了解和监测锈病病原菌进化的重要步骤，同时为禾本科R基因工程提供了途径。笔者还介绍了谷物锈病分离物单倍相参考序列的产生使得最近在谷物锈病病原学和效应生物学方面取得了几项突破。这些信息验证了Avr基因克隆研究在预测部署NLR基因的持久性和确认堆叠的种族特异性R基因的功能方面的实用性。每个克隆的R基因的相对有效性是基于从国际谷物疾病实验室收集的多种锈病和霉变病原体分离物的已发表表型应答数据。
6.用自然发生的隐性突变改变生物营养的成功
虽然在自然界中很罕见，但隐性遗传的非致命性功能丧失突变可以自发地发生在调节和促进锈病和霉变病原体生物营养摄食习惯的“易感性”(S)基因中。由于面包小麦的多倍体基因组，S基因的自发隐性功能缺失突变要么被耐受，要么被功能冗余的基因同源物掩盖。与多倍体小麦(6.7%)相比，大麦中锈病和霉病R基因的隐性比例(26%)更高，这可能是因为小麦中同源基因之间存在冗余。来自多倍体物种(如面包小麦)的S基因丧失功能突变迄今已赋予对多种生物营养病原体属和种的多效性抗性。然而，由于叶尖坏死，这些通常伴随着有害的产量惩罚性状。笔者介绍了多项相关研究，强调了通过基因编辑靶向多种S基因的能力，以提高耐药性，以此加强读者对宿主-病原体相互作用的理解。
7.利用机械多样性的基因堆叠
R基因金字塔化的中心规律表明，随着基因渗入、转化或培育成谷物品种的数量增加，病原体群体对多种抗性成分进化出相应的毒力就越具有挑战性。利用转基因和顺氏基因生物技术方法将R基因聚合，成功地调节了马铃薯对晚疫病的完全抗性。利用载体构建技术的发展和一套克隆R基因的可用性，将包含五个不同克隆R基因的堆叠转移到面包小麦中。这一组合被称为“五大”，包括克隆的Lr67/Yr46/Sr55/Pm46部分抗性基因和全阶段茎锈病R基因Sr22、Sr35、Sr45和Sr50，并已严格评估其有效性，以应对不同的全球种族的Pgt。在三个转基因系的T1后代中，所有5个全长基因作为一个基因座遗传，证实了每个基因的共插入。将R基因转化为面包小麦的锈病易感品种。尽管转基因幼苗对七种高毒力的全球Pgt分离株具有完全免疫力，但对叶锈病和条锈病敏感。这项研究强调了将4个高效的种族特异性NLR与一个额外的部分抗性基因结合起来控制茎锈病的有效性。该技术还表明，有机会将多个基因和/或基因堆栈引入同一品种，并设计含有不同基因组合的疾病特异性或多疾病R基因堆栈，以持久控制小麦和大麦的疾病。基于迄今为止在小麦中克隆的可用锈R基因，图2c描述了反映小麦三种锈病病原体不同机制作用和广泛功效的疾病特异性基因堆叠。就像小麦育种者在经受住时间考验的特定品种中结合了不同的抗锈病基因一样，大麦育种者似乎也结合了对小麦条锈病具有近乎非宿主抗性的基因。这种免疫在遗传上很简单，由三个QTL调控，包括编码NLRs的Rps6和Rps7，以及Rps8，一种物理上离散的基因复合体，编码Exo70Fx和受体样激酶。获得这些基因的分子特性为小麦的非宿主免疫工程提供了令人兴奋的前景。
8.创新方法提高转型效率
直到最近，农作物对农杆菌介导转化（ABMT）的抗性一直被认为是限制植物生物技术进展的最大瓶颈。这种抗性主要是由于宿主-农杆菌不相容的高频率，这是由植物诱导的强烈防御反应所导致的，而且农杆菌主要适应于感染双子叶植物。植物ABMT效率的遗传基础是复杂的，具有很强的基因型依赖性。在甘蓝和大麦中已经定位了几个QTL，允许基于单倍型的评估和选择，以提高ABMT效率。提高转化效率的可用选择是分离和操纵ABMT背后的因果基因，探索改进ABMT的方法或设计替代转化系统。改善ABMT的一种方法是通过工程农杆菌表达III型分泌系统，并传递从番茄病原菌丁香假单胞菌中提取的效应物AvrPto、AvrPtoB或HopA01来抑制植物防御。该技术将小麦、苜蓿和柳枝稷等多种植物的ABMT效率提高了250%-400%。该系统还允许以非转基因方式将植物组蛋白直接递送到植物体细胞中，以提高ABMT的效率。另一种方法是使用可生物降解的聚合物纳米复合物，通过内吞作用驱动的摄取，将簇状规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关核酸酶9(Cas9)核糖核蛋白(RNPs)递送到花粉粒中。利用该方法敲除了小麦纯合子基因型Gladius+Sr50克隆的茎锈病R基因Sr50的两个等位基因。提高ABMT效率或提供替代组织培养的能力对未来生物技术在难以转化的谷类作物中的应用具有重要意义。
最后对未来利用基因组学设计持久宿主抗性的可能性进行了展望。作者认为目前我们对作物抗病的分子基础的理解取得了重大进展，为知情的基因编辑提供了机会。基因磁带、S基因的基因编辑和转化效率的提高等快速创新，现在比以往任何时候都更有可能改善作物保护成果。理想情况下，有效的R基因组合应优先考虑机制多样性，以进一步提高抗性持久性的前景。在真菌生物营养/寄生习惯中涉及的特定S基因中自然发生的功能丧失突变代表了有希望的抗性机制。S基因通常编码在氨基酸水平上保守的营养转运体或酶，特别是在密切相关的作物物种之间，如小麦和大麦。因此，基因编辑的机会在于利用密切相关的作物物种(即小麦和大麦)之间的比较基因组学;然而，当编辑来自水稻等远亲的小麦中的S基因时，这种方法可能不太有效。虽然单独耐受性很低，但继续研究作为病原体效应诱饵的NLR及其ID是很重要的，因为NLR在多基因组合中使用时可能会赋予持久的抗性。虽然已经克隆了大量小麦和大麦锈病和白粉病R基因，为在小麦和大麦中设计强大的基因堆栈提供了基础，但笔者认为我们对许多克隆基因的功效的了解仍然不完整(图2)。为了最大限度地提高耐药性的持久性，重要的是将多个基因结合起来，赋予对每种现有病原体分离物的抗性。同时，考虑引入具有双重功能和作为易感基因促进破坏性坏死性真菌病原体感染的R基因的潜在影响也很重要。因此，需要对克隆的R基因对来自世界各地的当代病原菌分离株的耐药谱进行更全面的概述。笔者认为利用现有的种质资源和病原体资源来获得这种知识是复杂的，因为克隆的基因通常在不同的背景下含有其他有效的R基因。这些背景基因可以掩盖感兴趣的基因所赋予的抗性。目前，研究人员可以利用DNA合成的低成本和与品种无关的转化的新方案，将“所有”克隆的小麦和大麦锈病和霉病R基因纳入普遍易感的品种，即那些通常用作易感检查的品种。由此产生的真正的等基因集可以与世界各地的实验室共享，以进行深度表型分析。这种方法将提供实施负责任的基因管理所需的信息，允许明智地设计堆叠，以最大限度地降低选择抗抗性病原体变异的风险(图3)。在小麦中部署转基因磁带的一个重要考虑因素是世界各地小麦种植区对转基因技术的监管限制和社会政治反对。然而，一个含有来自向日葵Hb4转录因子基因的转基因耐旱小麦品系于2020年8月在阿根廷被解除管制。这种小麦的面粉后来在巴西、美国、哥伦比亚、尼日利亚、澳大利亚和新西兰获得批准，并于2023年3月在巴西批准了Hb4小麦的种植，从而预示着商业化转基因小麦的新时代。这些进展有望降低引入其他转基因性状的障碍，例如抗病性状。
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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14106
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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