以下文章来源于北京生物结构前沿研究中心 ，作者张颖
病原体能够产生多种效应蛋白操控宿主的细胞过程以为己谋利。然而，人们对这些效应蛋白如何产生功能的多样性知之甚少。疫霉菌（Phytophthora）是植物的毁灭性病原菌，其许多效应蛋白都含有“(L)WY”模体的串联重复，这种模体序列多变但结构保守。2023年6月26日，在Cell期刊发表了题为“Pathogen protein modularity enables elaborate mimicry of a host phosphatase”的文章。英国东英吉利大学的Wenbo Ma带领其团队与中科院生物物理所合作，在多个疫霉菌效应蛋白发现了特定(L)WY-LWY结合形成的一个功能模块，它可以在植物宿主中有效招募丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）核心酶。效应蛋白-PP2A复合物的晶体结构表明，(L)WY-LWY模块能够劫持宿主PP2A核心酶从而形成具有功能的全酶。尽管这些效应蛋白共享N端的PP2A互作模块，但其具有不同的C端LWY单元，调控宿主中不同的磷酸蛋白组。
疫霉属，如爱尔兰马铃薯饥荒病原体致病疫霉（Phytophthora infestans），是全球植物健康和食品安全的主要威胁1。每个疫霉菌基因组能编码上百种效应蛋白，对疾病的发展至关重要2-4。效应蛋白在不同的物种中具有高度的多样性，反映了其在适应宿主过程中的加速进化3，5。其中，(L)WY模体可能参与了其进化。该模体因保守的氨基酸得以命名，即包含了多个亮氨酸（L），一个色氨酸（W）和一个酪氨酸（Y）。对五个疫霉属基因组进行预测，发现了约三百个效应蛋白含有(L)WY模体的串联重复。对其中一个效应蛋白——大豆疫霉RNA沉默抑制因子（Phytophthora suppressor of RNA silencing 2，PSR2）进行结构分析表明，每个(L)WY模体都形成了一个几乎相同的α螺旋束，相邻的单元通过保守的机制相连，形成了类似关节的连接6。有趣的是，这些效应蛋白通常是具有不同表面氨基酸的(L)WY单元的嵌合体，意味着其与宿主靶标互作能力的多变。然而，(L)WY模体能否通过直接介导与宿主靶标的特异性互作而在效应蛋白中作为功能模块，以及LWY效应蛋白的模块构造如何促进疫霉属的效应蛋白进化，目前依然未知。
为了研究LWY单元是否能够介导与特定宿主分子的互作，研究者们通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）鉴定了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的PSR2互作蛋白。结果表明PSR2与拟南芥的PP2A结合（图 1A）。PP2A负责真核生物中的大多数丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性并调控多种细胞功能，其高度保守的核心酶为一个脚手架A亚基和催化C亚基组成的异源二聚体，由调控B亚基招募至特定的亚细胞定位和底物处。其中，B亚基决定着全酶的功能。拟南芥能够编码3种A亚基、5种C亚基和17种B亚基，PSR2能与所有的A和C亚基共沉淀，但无法与B亚基共沉淀（图 1A和B）。转基因植物组织富集得到的PSR2可以被PP2A特异性抑制剂冈田酸（okadaic acid，OA）完全抑制其磷酸酶活性（图 1C），意味着PSR2与拟南芥PP2A核心酶在植物中形成了功能性全酶。这种互作和功能性全酶的形成在表达PSR2的烟草（Nicotiana benthamiana）中同样被证实。
在之前的报道中，PSR2能够增加拟南芥对辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的敏感性。对此，研究者们在PP2A蛋白A亚基突变株rcn 1中表达了PSR2，观察到其毒性几乎被消除（图 1D）。由于PP2A的酶活由催化亚基C决定，研究者们在拟南芥C亚基突变株pp2a-4种表达了PSR2。与rcn 1相似，pp2a-4的PSR2毒性也几乎被清除（图 1E），表明了PSR2在植物宿主中的细胞功能依赖于PP2A的磷酸酶活性。这些突变株也表现出了对P. capsici的耐受，与其作为PSR2易感靶标的作用一致。
图1 PP2A核心酶是疫霉效应蛋白PSR2的易感靶标
随后，凝胶过滤结果表明，PSR2与A亚基RCN1和PDF1均能形成稳定的二元复合物（图 2A），但无法与人源C亚基形成（C亚基在多种表达体系中均以包含体形式存在，无法拿到可溶蛋白，因此以高度保守的人源C亚基Cα代替）。所解析的PSR2（氨基酸59-670）-PDF1（氨基酸1-390）复合物晶体结构分辨率达2.3 Å（图 2B）。其中，PDF1以弧状结构存在，其N端部分与PSR2的LWY2-LWY3区域互作。PSR2的WY1-(LWY)6整体结构呈棍状，与之前的报道一致6。PSR2与LWY3的第三个α螺旋（后续称为α3）形成的互作界面作为核心，α3嵌入到PDF1表面的一个沟中，与PDF1形成了多个氢键和π-π相互作用（图 2C和D）。α3中的氨基酸R256和Q263分别堆积在PDF1W138和PDF1F139的侧链上，通过π-π相互作用稳定复合物（图 2D）。此外，R256和E260分别与PDF1T96和PDF1F139形成氢键。因此，α3的这种“REQ”三联体在PSR2-PDF1复合物的形成中具有关键作用。LWY3两侧的连接（L1和L2，图 2C）富含带电氨基酸，包括L1中的K299、Y303、E307和D310（图 2E）以及L2中的K211、K215、K219和Q221（图 2F）。这些氨基酸通过与PDF1形成盐桥或氢键进一步稳定了复合物。随后，通过突变这些氨基酸，研究者们进一步验证了其在PSR2-PDF1相互作用中的角色（图 2G-I），实验结果证实了PSR-PDF1复合物结构中定义的互作界面，表明了(L)WY单元可以作为功能模块，介导PSR2与宿主PDF1或其它PP2A蛋白A亚基的直接相互作用。
PDF1在PSR2-PDF1复合物中的结构与人PP2A蛋白A亚基PPP2R1A高度保守。有趣的是，尽管PSR2在结构上与所有已知的人PP2A蛋白B亚基不同，但它结合在A亚基N端部分相似的区域（图 3A）。许多PDF1与PPP2R1A中保守的氨基酸分别参与了与PSR2和人B亚基的互作（图 3B）。这意味着PDF1中的PSR2结合位点可能与内源植物B亚基结合位点有所重合，导致它们在PP2A全酶中相互排斥。
图2 PSR2通过(L)WY2- LWY3形成的界面与PP2A的A亚基互作
为了证明PSR2是否能够与内源B亚基竞争招募PP2A核心酶，研究者们对比了二者的结合亲和力。等温滴定量热法（ITC）实验结果表明，B亚基ATB′γ-PDF1的Kd值约为PSR2-PDF1 Kd值的十倍（图 3C）。此外，该研究利用PDF1与人C亚基Cα形成的异源二聚体进行了体外竞争实验。向提前形成的PDF1-Cα-ATB′γ复合物中加入PSR2后，PSR2取代了ATB′γ并与PDF1-Cα核心酶形成了全酶（图 3D）。相反，ATB′γ无法高效地使PSR2从预先形成的PDF1-Cα-PSR2全酶中解离出来（图 3E）。这些结果表明，PSR2可以作为B亚基的模拟物竞争性招募PP2A核心酶。
考虑到LWY效应蛋白的模块化构造，研究者们推断任何含有PSR2 (L)WY2- LWY3模块的效应蛋白都能够招募PP2A核心酶。通过序列和结合相似性、AlphaFold2以及互作位点保守性分析，研究者们选取了15个效应蛋白进行实验验证。这些效应蛋白分别在烟草中表达，以富集效应蛋白复合物，并检测其与PP2A蛋白A亚基的互作及磷酸酶活性（图 4A）。结果表明，其中的12个候选效应蛋白均能在植物中与PP2A形成功能性全酶，包括一个致病疫霉的PSR2同源蛋白PiPSR2（图 4A）。在13个能与植物PP2A核心酶结合的效应蛋白中，研究者们观察到它们均含有至少五个WY/LWY单元，且预测的PP2A结合模块总是位于N端（图 4A）。这些发现表明效应蛋白与PP2A核心酶的结合具有相似的机制。
图3 PSR2是B亚基的模拟物，可以有效招募宿主核心酶并形成功能性全酶
PP2A全酶的底物特异性由特定的B亚基决定。疫霉属具有一系列效应蛋白，它们具有相同的PP2A互作模块并总是位于N端，均作为B亚基的模拟物发挥功能。PSR2-PDF1复合物与人PP2A全酶的结构相似性表明，PSR2的C端LWY单元可能负责底物的结合，而C端LWY的多样化可能导致了其功能的多样性。结构和序列的相似性分析发现，C端的LWY整体多样性高于N端的PP2A互作单元（图 4B）。
图4 12个效应蛋白N端具有PSR2相似的PP2A互作模块，而C端具有多样的LWY单元
为了进一步研究PP2A互作效应蛋白的功能保守性和多样性，研究者们解析了致病疫霉效应蛋白PITG_15142的晶体结构，分辨率达3.1 Å（图 5A）。PITG_15142的N端(L)WY单元具有WY1-(LWY)4构造以及预测的PP2A互作模块，且其WY1-LWY2与PSR2的(L)WY2-LWY3具有显著的结构相似性（图 5B）。二者具有保守的互作氨基酸，包括与REQ三联体相关的氨基酸，且REQ三联体氨基酸的突变能够破坏PITG_15142与PDF1在体外和植物内的互作（图 5C）。此外，突变也会破坏磷酸酶活性以及影响辣椒疫霉对烟草的侵染（图 5D）。这些结果证实了PITG_15142，可能还包括其他具有PP2A互作模块的LWY效应蛋白，具有与PSR2相同的PDF1互作和效应蛋白-PP2A全酶形成机制。
图5 PSR2和PITG_15142影响不同宿主蛋白的磷酸化
尽管PSR2和PITG_15142具有相似的PP2A相互作用，但其C端单元具有差异，意味着其具有潜在的底物结合差异（图 5E）。利用液相色谱-质谱（LC-MS），该研究进行了无标记的定量磷酸蛋白组学分析，检测并定量了四千多种蛋白中的上万种磷酸肽。效应蛋白对蛋白磷酸化没有整体的影响，但影响了特定肽的磷酸化状态。在突变株rcn1-6中表达PSR2时，野生型中磷酸化降低的肽段大部分不再降低（图 5F和G）。意味着PSR2依赖于拟南芥PP2A核心酶，从而介导宿主蛋白去磷酸化。基因本体（gene ontology，GO）分析发现，PSR2降低磷酸化的蛋白在核苷碱基化合物的生物合成过程中富集（图 5H）。而PITG_15142降低磷酸化的蛋白主要参与对真菌和干燥的响应（图 5H）。重要的是，只有一种肽在表达PSR2和PITG_15142的植物中均显示磷酸化降低，这与两种效应蛋白调控不同宿主蛋白的磷酸化观点一致（图 5I）。
图6 阐述基于LWY重复单元的蛋白模块如何促进效应蛋白进化的模型图
综上所述，研究者们以PSR2为模型，探究了(L)WY单元在毒性中的角色以及基于(L)WY的模块在效应分子进化中的作用。该研究发现PSR2能够与植物宿主的PP2A核心酶结合并形成功能性全酶。通过劫持宿主磷酸酶，PSR2改变了特定宿主蛋白的磷酸化以促进疾病的发展。对PSR2-PP2A复合物晶体结构的解析和生化分析揭示了PSR2的(L)WY2-LWY3对竞争结合PP2A核心酶的关键作用。此外，基于结构在两种疫霉中鉴定了12个具有此功能模块并能与PP2A形成全酶的效应蛋白。其PP2A互作模块总是位于效应蛋白的N端，而其C端具有多变的LWY单元。通过磷酸蛋白组学分析，研究者们观察到了效应蛋白对宿主蛋白的影响，表明了PP2A互作模块与不同LWY单元的结合导致了功能的多样性。强调了一个主要的蛋白磷酸酶作为疫霉的易感靶标，为蛋白模块如何推动一系列效应蛋白的多样化发展提供了见解。这些蛋白模块可以作为串联重复进行排列组合，促进效应蛋白的进化，产生新的宿主操纵活动（图 6）。
原文链接
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00640-2
参考文献
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