01
研究背景
缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是一种由中枢神经系统局灶性损伤引起的急性神经损伤，是死亡和残疾的一个主要原因。目前临床上抗IS治疗药物有三类：溶栓剂、抗凝剂和抗血小板剂。但患者发生缺血性脑卒中时，需在4.5小时内进行溶栓治疗，这个时间窗口并不容易被所有患者满足。抗凝剂和抗血小板药通过抑制或激活特定的抗血栓或抗血小板相关靶点来发挥其抗IS作用。在患者发生缺血性脑卒中48小时内给予抗血小板治疗可以降低缺血性脑卒中早期复发的风险。然而在一些IS患者中，紧急抗凝治疗会导致患者症状性颅内出血。因此，有必要探索IS的新疗法和替代疗法，临床使用的中药可能为新型抗IS药物的开发提供有前景的资源。
在临床上，灯盏细辛注射液（Deng-Zhan-Xi-Xin injection，DZXXI）被广泛用于治疗心脑血管疾病（如缺血性脑卒中、冠心病、心绞痛）。已经有很多临床试验结果表明DZXXI对缺血性脑卒中的益处。药理证据表明，DZXXI可抑制血小板聚集，抑制白细胞-血小板粘附，减少动脉粥样硬化，调节患者免疫反应，减轻炎症损伤，防止ROS介导的氧化作用，减轻脑水肿等。但是DZXXI在分子层面的作用机制尚未明确，需要进一步研究。
02
研究概述
作者首先预测了DZXXI给药后血浆中活性化合物的可能靶点。经过广泛的数据收集，组合了两组与IS相关的基因以及两组抗IS的药物。通过对这些收集的数据集进行分析后识别出DZXXI的两个重要靶点。构建DZXXI的“药物-靶点-通路”互作网络，以及分析识别出DZXXI的可能靶点所调控的关键通路。接着，构建了一个有符号的人类信号网络，以及使用signed random walk with restart (SRWR)算法识别出最受DZXXI抑制的靶点。将DZXXI治疗后的差异表达基因进行CMap分析，寻找可能具有与DZXXI相似生理作用的药物。对识别出的显著抑制的基因/蛋白进行功能注释、通路富集等有助于阐明DZXXI的潜在抗IS机制。最后进行了一系列的体外和体内实验，以验证从计算分析中推断出的DZXXI的预测靶点和功能。
03
研究方法与结果
1.识别DZXXI的重要靶点
作者首先从4个数据源分别收集了疾病相关基因和抗IS的药物靶基因各两组：（1）在DISGeNET中以“ISchemic stroke”为关键词进行查找，得到389个该病相关的基因。在GSE22255（缺血性中风外周血的相关测序数据集）中得到了559个DEGs（差异表达基因；其中279个上调，280个下调）。（2）在KEGG的通路“antithrombosIS agents”（ID:07049，抗血栓药）得到了25个抗凝剂或抗血小板药物以及它们的16个靶点；在DrugBank中获得了35个抗凝或抗血栓药物，以及75个相关的靶点。4个数据源中共有3个相同的基因（图1A），说明它们在IS病理和治疗中的重要作用。并且它们在GSE22255中过表达。DZXXI的靶点与KEGG targets和与IS相关的基因有2个重叠，即PTGS2和PTGS1（图1B），说明这两个基因在IS的治疗中具有重要作用。此外，这两个基因被DZXXI的4个化合物所靶点（caffeic acid, apigenin, quercetin-3-O-glucuronide与 kaempferid-3-o-glucuronide）。
图1 不同基因组之间的重叠基因。(A) DISGeNET中的疾病基因(DISease genes)、GSE22255数据集中的差异表达基因(Diff genes)、KEGG和DrugBank数据库中抗IS药物靶基因(KEGG targets，DrugBank targets)之间的重叠；(B)来自DISGeNET的疾病基因、KEGG数据库中抗IS药物靶基因和潜在DZXXI靶基因(DZXXI targets)之间的重叠。
2.构建和分析“药物-靶点-通路”网络，识别DZXXI调控的重要通路
由图2A可知，DZXXI具有多成分、多靶点的特点。作者将含有抗IS的药物靶点的KEGG通路作为抗IS的通路。作者将KEGG中获得的抗IS药物的所有靶点映射到KEGG的通路上，确定了29条抗IS相关通路，从而构建了KEGG的抗IS药物的“药物-靶点-通路”网络（图2B图）。如果通路中所有的靶点与抗凝剂/抗血小板相关，则认为这条通路收抗凝剂/抗血小板药物调控。分别有7，18，4条通路受抗凝剂，抗血小板药物，以及两种药物所调节。其中"Complement and coagulation cascades" and "Platelet activation"这两条通路包含了两类药物最多的靶点，所以认为分别是抗凝与抗血小板最重要的通路（图2B图）。将DZXXI的潜在作用靶点映射到29条抗IS的相关通路中，构建灯盏细辛的“靶点-通路”网络，结果显示有37个DZXXI作用靶点与25条抗IS通路相关，分别有16、5、4通路与抗血小板药物、抗凝剂及这两类药物相关。而大多数DZXXI潜在作用靶点在抗血小板调节的通路上。只有7个靶点富集在抗凝的通路上，并且最重要的抗凝通路“Complement and coagulation cascades”没有被富集到（图2C）。经过DZXXI处理后得到的大多数DEGs参与了抗血小板药物调节的通路（图2D）。
图2 抗IS药物与DZXXI的“靶点-通路”网络图。(A) DZXXI有效成分的“药物-靶点”网络；(B)基于KEGG的抗IS药物的“药物-靶点-通路”网络；(C)DZXXI潜在作用靶点的“靶点-通路”网络；(D) DZXXI处理下差异表达基因的“基因-通路”相互作用网络。
3.使用SRWR算法预测和识别出显著被抑制的靶点
通过SRWR算法识别出了被药物（DZXXI, Apigenin, Apigenin-7-O-glucuronide, Quercetin-3-O-glucuronide, Anticoagulants, Antiplatelets）显著抑制的216个基因。作者认为如果验证基因集中的大部分基因（即IS的上调基因、IS疾病的相关基因、抗IS药物的靶点）被该药显著抑制，则认为该药对IS具有治疗作用。结果表明（表1），三个验证基因集中都包含了被DZXXI显著抑制的基因，而DZXXI处理后得到的差异表达基因与两个验证基因集中都有重叠。这些结果表明DZXXI具有抗IS作用。然而，两种活性DZXXI化合物(apigenin， apigenin-7-O-glucuronide)抑制最强烈的基因与三个验证基因集均没有重叠。这暗示了DZXXI的抗IS作用是由多种化合物协同作用产生的，而不是由单一的有效成分起作用。
表1 被各组药物显著抑制的基因与3个验证基因集的重叠基因数量
4.DZXXI显著抑制基因的功能注释
作者接着使用DAVID对216个显著抑制基因进行不同层面的功能注释。表2展示了被DZXXI显著抑制的基因及DEGs中属于被显著抑制基因的疾病层面富集结果，暗示了DZXXI显著抑制了大量与缺血性脑卒中和炎症相关的基因，进一步证明了DZXXI对IS的治疗作用。
表2 与DZXXI和DEGs相关的显著抑制基因的疾病层面的富集结果
为了研究DZXXI抑制的基因是否在缺血性脑卒中靶组织中表达，作者采用DAVID进行组织富集分析。结果表明这些基因大多分布在脑，血管内皮和血小板，尤其是脑组织（表3）。约有一半的显著抑制基因在大脑中表达，暗示了灯盏细辛可抑制缺血性脑卒中靶组织蛋白产生抗IS作用。
表3 与DZXXI和DEGs相关的显著抑制基因的组织层面的富集结果
通路富集得到了15条与抗IS相关的通路，几乎所有富集的通路都与抗血小板相关，暗示了DZXXI的抗血小板的作用（图3A和3B）。
图3（A）属于DZXXI的显著抑制靶点所富集的抗IS相关通路；（B）属于差异基因的显著基因所富集的抗IS相关通路。
5.通过CMap分析识别具有相似作用的药物
在CMap数据库中分析经DZXXI及其三种活性化合物(芹菜素、芹菜素-7- o -葡萄糖醛酸盐和槲皮素-3- o -葡萄糖醛酸盐)处理MCF-7细胞后的差异表达基因，从而得到与DZXXI具有相似作用的药物。表4表明DZXXI及其三种活性化合物与非甾体抗炎药(NSAIDs)、血管扩张剂、降压药、降糖药、抗心律失常药等抗IS相关药物具有较高的相关性，说明DZXXI具有潜在的抗IS特性。尤其非甾体抗炎药占三分之一以上的比例，提示DZXXI与非甾体抗炎药一样具有抗血小板和抗炎作用。
表4 CMap中抗IS的相关药物
6.体外和体内验证DZXXI重要靶点及其相关效应
作者对DZXXI的4种有效成分(caffeic acid, apigenin, quercetin-3-O-glucuronide与 kaempferid-3-o-glucuronide)与它们的靶向蛋白PTGS1和PTGS2分别进行了体内和体外模型研究，以验证化合物与靶标之间的结合潜力。分子对接结果表明，caffeic acid与这两种蛋白质的对接分数非常接近天然化合物的对应分数，而其他三种化合物的对接分数明显大于天然化合物的对应分数。这表明PTGS1和PTGS2与四种DZXXI化合物具有很强的结合（图4A和4B）。caffeic acid对PTGS1和PTGS2活性均有抑制作用。高浓度的apigenin和quercetin-3-O-glucuronide仅能轻微抑制PTGS1，但不能抑制PTGS2(图4C和4D)。细胞热移测定显示只有caffeic acid与PTGS1具有特异性结合亲和力。与DMSO相比，caffeic acid显著增加了56°C温度下PTGS1蛋白的积累（图4E）。采用血小板聚集法检测DZXXI及其试验化合物的抗血小板活性。结果表明，caffeic acid对血小板聚集具有抑制作用，而芹菜素和槲皮素-3- o -葡萄糖醛酸酯具有轻微的抗血小板活性(图4F)。此外，DZXXI以浓度依赖性的方式显著抑制血小板聚集（图4G）。通过小鼠模型评价DZXXI在体内的潜在神经保护和抗血小板活性，结果表明DZXXI可以明显减少平均脑梗死面积（图4H）以及TXB2的血清水平（图4I）。
图4 重要靶点和作用的实验验证。(A / B) DZXXI的四种化合物与PTGS1 (A)和PTGS2 (B)两种蛋白之间结合强度的分子对接得分；(C / E) DZXXI活性化合物对PTGS1/2酶的抑制活性以及caffeic acid与PTGS1的结合亲和力；在细胞裂解物中测定的咖啡酸与PTGS1的细胞热移测定曲线(E)证实了caffeic acid与PTGS1的结合亲和力；(F + G) 3个化合物(F)和DZXXI (G)的抗血小板活性。(H) DZXXI对MCAO大鼠的神经保护作用；(I) DZXXI对血栓素B2 (TXB2)水平的影响。
综上，作者提出了一种新的计算系统药理学方法，用于研究具有未知作用机制的中药。从靶点、通路、网络、生物医学功效等层面推断中药方剂的作用方式。探讨了中药DZXXI的作用机制。从靶标角度来看，DZXXI的4种化合物与NSAIDs具有相似的靶标(即前列腺素合成酶PTGS1和/或PTGS2)。从通路角度看，DZXXI的靶点在对神经元存活至关重要的3条通路中显著富集，而活性DZXXI化合物靶向的是位于3条通路上游的TNF-α。从网络的角度来看，DZXXI通过网络传播，抑制了缺血性卒中靶组织中表达的一组基因。这些基因与缺血性组织损伤和炎症显著相关，并在抗血小板和神经保护相关途径中富集。从药物疗效角度，通过基因表达的CMap分析结果表明，DZXXI对细胞的生理作用与一组抗IS药物，特别是NSAIDs具有相似的抗炎和抗血小板作用。综上所述，计算分析表明DZXXI可作为抗炎、抗血小板和神经保护剂发挥其抗IS作用。
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.phrs.2019.104365
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