新型仿生水下胶黏剂的构建不仅是寻找合适模型体系，揭示天然水生附着生物黏性蛋白质水下粘接机制的重要途径，也是开发性能可调、操作简便、良好生物相容性医用胶黏剂的必经之路。当前报道的绝大多数仿生水下胶黏剂以合成或半合成的聚合物或重组蛋白两类体系为主。短肽分子在模拟天然蛋白质结构与功能，创建生物活性材料方面展现了独特的优势。与蛋白质相比，短肽分子具有组成类似、结构简单、序列可调、性质可控、化学合成方便、可批量制备的特点，是揭示复杂蛋白质结构与功能机制的理想模型体系。与聚合物相比，短肽分子具有生物相容性好，可生物降解，安全性高的优点。构建基于短肽的仿生水下胶黏剂体系为深入理解天然黏性蛋白的残基协同效应，开发性能优异的医用胶黏剂提供了无限可能。
吉林大学化学学院超分子结构与材料国家重点实验室李文教授与吉林大学第二医院赵建武教授在国家自然科学基金和吉林大学交叉融合项目的资助下重点围绕肽基新型仿生水下胶黏剂的设计开展了系列合作研究。他们借鉴超分子聚合的策略先后制备了系列基于氨基酸及短肽的交联超分子聚合物(Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 8731; Biomacromolecules 2017, 18, 3524; Adv. Funct. Mater. 2018, 28, 1800599; Soft Matter, 2019, 15, 9178; J. Mater. Chem. A, 2022, 10, 7207; Langmuir 2023 DOI: ; Adv. Healthcare Mater. 2023, 2203301.)，并实现了其在水环境中的在位注射、界面铺展、粘附与固化过程(Langmuir 2019, 35, 4995; Chem. Commun., 2020, 56, 11034; Biomacromolecules 2022, 23, 1009)。近日，作者在前期工作的基础上报道了一类有阳离子短肽和甘草酸纳米纤维组成的交联超分子聚合物。该聚合物展现了良好的水下粘接能力、组织黏附性、生物相容性，可降解性，便利的可操作性。体外和体内实验证实，短肽/甘草酸交联超分子聚合物经干燥所得的粉末具有遇水即黏的特性，可直接用于动物破损硬脑膜的有效密封和修复。相关工作以“Peptide/glycyrrhizic acid supramolecular polymer: an emerging medical adhesive for dural sealing and repairing”为题发表在 Biomaterials上。
【文章要点】
在这项研究中，作者仅将包含精氨酸的短肽(PEP1)水溶液与甘草(GA)酸水溶液在生理pH（7.4）条件下一步混合即可在宏观尺度上观察到黏性超分子聚合物PEP1/GA（如图1所示）。整个制备过程条件温和，操作简便，可大量制备。等温量热滴定分析表明该交联聚合是焓主导的热力学过程。超分子聚合物内部包含高度交联的致密结构（图2a, 2b），使其具有较强的内聚力、模量和机械强度，以及良好的抗溶胀性。X-射线光电子能谱（图2c, 2d）实验证实两种组分在pH 7.4的水溶液中分别以质子化的胍基和去质子化的羧酸盐形式存在，两者间的多重静电吸引力和氢键是形成宏观超分子聚合物的主要驱动力。详细研究表明短肽序列中的精氨酸残基是形成短肽超分子聚合物的决定因素，质子化胍基的独特分子结构可与甘草酸的羧基间形成双齿氢键，其平面结构和pi电子特性则有利于分子间的紧密堆积。此外，将强疏水性氨基酸残基编码在短肽序列中有利于提高聚合物的内聚力。
图1. (a) 短肽分子(PEP1)的化学结构示意图；(b) 甘草(GA)酸分子堆积示意图；(c) 短肽/甘草酸交联超分子聚合物(PEP1/GA)的制备过程及交联模型示意图。
图2. (a)短肽/甘草酸交联超分子聚合物的扫描电镜图；(b)扫描电镜局部放大图(a中黄色方框区域)；(c) 短肽/甘草酸交联超分子聚合物的XPS 光电子能谱(N 1s)；(d) 短肽/甘草酸交联超分子聚合物的XPS 光电子能谱(C 1s).
所得短肽/甘草酸交联超分子聚合物(PEP1/GA)对不同固体基底均展现了良好的水下粘接性能（图3a）。定量剪切拉伸测试表明其在25 ℃条件下对金属钛、聚醚醚酮、不锈钢、聚丙烯的水下粘接强度分别为47.4 ± 4.5, 32.6 ± 4.1, 29.4 ± 3.4, 30.9 ± 3.8 kPa（图3b）。在生理温度，由于聚合物中非共价键强度的温度敏感性，其水下粘接强度有所降低（图3c）。尽管如此，其在37 ℃下对猪皮的水下粘接强度依然能达到18.8 ± 1.4 kPa, 这一数值高于相同条件下临床使用的血纤维蛋白胶对猪皮的粘接强度 (11.1 ± 1.8 kPa)。需要强调的是，溶剂水的存在可适当减弱聚合物中极性键的键强度，使交联网络具有一定的动态性，这是形成黏性聚合物的必要条件。黏性超分子聚合物一旦失水后即可转变为固体并失去界面粘附性和粘弹性。然而，干燥的固体经研磨成粉后的样品可在水环境下快速吸水并重新转变为水下胶黏剂（图3d）。如将这种遇水即黏的粉末样品直接喷洒在湿的或含水的固体表面，粉末样品原位吸水后不仅可以重新转变为胶黏剂，同时其吸水过程也可有效移除固体表面的水化层，改善样品与基底表面的粘附效果，提高其水下粘接强度。这种遇水即黏的干燥粉末便于日常存储、运输和后续的临床操作。体外爆破压试验表明，粉末样品在破损猪肠衣表面原位吸水后形成的胶黏剂具有良好的封堵效果，胶黏剂的爆破压可达66.9 ± 6.3 厘米水柱，高于人体正常脑脊液的压力。
图3. (a) 短肽/甘草酸交联超分子聚合物(PEP1/GA)对不同固体基底的水下粘接性能,包括钛，不锈钢，聚醚醚酮，聚丙烯，猪皮，心脏组织，肾脏组织及肝脏组织；(b) 聚合物在室温下 (25 ℃) 对不同基底的水下剪切粘接强度；(c) 聚合物在生理温度下 (37 ℃) 对不同基底的水下剪切粘接强度，以及市售血纤维蛋白胶在生理温度下对猪皮的剪切粘接强度；(d) 短肽/甘草酸交联超分子聚合物失水干燥成粉及吸水后重新转变为水下胶黏剂的实物图。
本文以大耳兔为动物模型评估了短肽/甘草酸超分子聚合物对破损硬脑膜（5 mm长的切口）的封堵和修复效果（如图4a所示）。实验数据表明硬脑膜破损后脑脊液从切口位置持续渗漏，将以上所得的短肽/甘草聚合物粉末样品铺洒在切口处时，粉末可快速吸收渗漏的脑脊液，在移除硬脑膜表明水化层的同时转变为黏性聚合物实现原位黏附，并有效阻止脑脊液的进一步渗漏，实现快速、有效的封堵（如图4b所示）。硬脑膜被成功封堵后，作者对外围皮肤组织实施手术缝合，并观察大耳兔在不同时间的脑脊液渗漏情况。在相同手术条件下，作者将不做任何处理的空白组和经市售血纤维蛋白胶处理的对照组与以上实验组进行比较，核磁共振成像（MRI）结果显示经短肽/甘草酸粉末处理的模型在术后一周和两周都没有明显的脑脊液渗漏。然而，经血纤维蛋白胶处理的对照组在术后一周内出现明显渗漏，未经处理的空白组在术后一周和两周都观察到了大量脑脊液的渗漏。
图4. (a)以日本大耳兔为动物模型构建的缺损硬脑膜示意图；(b) 缺损硬脑膜脑脊液渗漏(如图中黑色箭头所示)，短肽/甘草酸聚合物(PEP1/GA)粉末样品覆盖缺口及原位吸收渗漏脑脊液形成胶黏剂实现及时封堵的实物图。
在设定的时间点重新打开缝合皮肤后也可以看到术后一周内经短肽/甘草酸粉末处理的实验组未见脑脊液渗漏，两周后新生肉芽组织完全覆盖缺口，三周后基本愈合（如图5最左侧一列所示）。然而，对照组（图5中间一列）和空白组（图5最右侧一列）在术后一周内均观察到脑脊液渗漏，两周内均出现明显炎症反应。三周内，对照组初步愈合，但新生组织并不平滑且周围依然存在少量炎症反应，而空白组愈合缓慢。在设定的时间点收集封堵部位的硬脑膜组织进行组织学分析后发现，与对照组和空白组相比，经短肽/甘草酸粉末处理的实验组的封堵效果最为显著，硬脑膜缺损位置周围出现更明显的纤维组织，并对缺口形成完全覆盖，且纤维沉积更厚、更致密。这些结果说明由短肽和甘草酸形成的黏性超分子聚合物对破损硬脑膜具有良好的封堵和修复效果。
图5. 短肽/甘草酸聚合物粉末样品处理，市售血纤维蛋白胶处理和不做处理的动物硬脑膜缺损模型分别在术后不同时间点处死后缺损部位的封堵与修复情况。
本工作分别从细胞毒性，溶血性，炎症反应等角度评价了短肽/甘草酸交联超分子聚合物的生物相容性。将聚合物浸泡在细胞培养液中静置24获得饱和浸提液（浓度定义为100%），然后将饱和浸提依次梯度稀释获得不同浓度的浸提液样品，并与小鼠胚胎成纤维细胞或PC12嗜铬瘤细胞共培养。光密度结果显示共培养后两种细胞的存活率均高于85%（图6a）。样品经活死染色后的共聚焦荧光显微镜实验进一步说明该聚合物具有良好的细胞毒性（图6b）。溶血实验证实与浸提液共培养后血红细胞的形态保持完好，不同浓度的浸提液样品其溶血率均小于3.5%，低于标准水平（5%）。体内皮下降解实验发现所得短肽/甘草酸交联超分子聚合物可在两周内完全降解（图7），这一降解周期接近硬脑膜组织的自修复时间窗口。在不同植入时间点取短肽/甘草酸胶黏剂周围组织样本后进行组织切片分析，HE染色实验表明该分子聚合物没有引起明显的炎症反应，这得益于构成聚合物的组分均为生物相容性良好的化合物。
图6. (a) 不同浓度短肽/甘草酸聚合物浸提液与小鼠胚胎成纤维细胞共培养后，培养液的光密度值；(b) 共培养后的样品经calcein AM和 propidium iodide染色后的共聚焦荧光显微镜图。
图7. (a) 以大鼠为模型开展的短肽/甘草酸胶黏剂皮下降解实验示意图；(b) 短肽/甘草酸胶黏剂植入大鼠皮下后不同时间的实物图；(c) 胶黏剂周围组织的HE图。
这项工作证实了交联超分子聚合策略在构建生物相容性短肽水下胶黏剂中的有效性，揭示了短肽序列中精氨酸残基与羧酸类共体的独特作用方式在交联聚合过程中的重要性，阐明了交联组装的热力学过程及短肽序列中各氨基酸残基的贡献，展现了短肽交联超分子聚合物在组织封堵、愈合方面的应用潜力。本工作为进一步开发性能可控，可定制的短肽医用胶黏剂奠定了基础。论文的第一作者为吉林大学化学学院超分子实验室刘晓欢博士，共同第一作者为吉林大学第二医院程学良博士。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961223002478
来源：BioMed科技
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