胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命的消化道癌症，5年生存率不到7%。超过70%的患者在被诊断为胰腺癌时已经错过了手术机会。目前，胰腺癌对化疗或免疫治疗的反应率较低且受限于全身毒副作用。微创不可逆电穿孔（IRE）消融对于无法手术切除的胰腺癌是一种可行选择。它利用高频电场在细胞膜上引起纳米级穿孔，扰乱细胞稳态并导致强免疫原性细胞死亡（ICD）和抗原释放。IRE消融能够摧毁肿瘤而不损伤周围血管和神经，并有效降低了发生胰漏和出血的风险，在局部实体肿瘤治疗中显示出优势，但这种肿瘤类型所特征的免疫抑制性肿瘤微环境会导致肿瘤复发。因此，加强内源性适应性抗肿瘤免疫对于改善消融治疗和消融后免疫治疗结果至关重要。
近期，上海交通大学医学院附属瑞金医院王忠敏/崔文国团队共同开发了一种可注射的水凝胶微球疫苗，可以刺激cDC1介导的抗原交叉呈递级联反应。在带有胰腺肿瘤的小鼠中，水凝胶疫苗与消融治疗相结合有效促进了cDC1/CD8+ T细胞抗肿瘤免疫系统性扩增，抑制了胰腺癌的进展并抑制远处转移瘤的生长。相关工作以“Interventional hydrogel microsphere vaccine as an immune amplifier for activated antitumour immunity after ablation therapy”为题发表在《Nature Communications》杂志，文章第一作者为刘霄宇。
【文章要点】
本研究中，研究人员设计了一种靶向CD103+CD11b-cDC1s的水凝胶微球疫苗。首先将Cas9质粒和CD40L载入脂质体和CaCO3中，然后分别将纳米颗粒与FLT3L细胞因子和透明质酸（HA）混合，在微流控控制下制备水凝胶微球疫苗。（图1）
图1.水凝胶微球疫苗的合成过程和免疫激活原理。
随后研究人员对水凝胶微球疫苗进行了功能验证。首先评估了水凝胶微球疫苗在pH=为6.8时释放FLT3L和CD40L细胞因子的效率，显示FLT3L在24h时的累积释放率达到48.5%，而CD40L在24h时的释放率仅为9.3%，却在72h时则增加到54.1%，说明水凝胶微球疫苗在酸性环境下实现了双细胞因子的释放。随后研究了水凝胶微球疫苗和电穿孔的结合对质粒转染到多个细胞系的影响，流式细胞术分析显示，水凝胶微球疫苗在电穿孔后转染了60%以上的细胞（Panc02、KPC、AsPC1或3T3细胞），几乎是裸质粒电穿孔组的2倍（p<0.0001），表明，水凝胶微球疫苗显著增加了电穿孔介导的细胞质粒转染量。最后，研究人员评估了水凝胶微球疫苗对体外骨髓源性树突状细胞（BMDCs）成熟和激活的影响，在与IL-4和GS-CSF预孵育后，额外的FLT3L或水凝胶微球疫苗显著促进BMDCs分化为CD103+CD11b-cDC1s样细胞，同时水凝胶微球疫苗也提高了cdc1的增殖能力，并且其共刺激分子（CD80、CD86、CD40和MHC-I）的表达相对于空白微凝胶对照细胞几乎增加了一倍。这些发现表明，水凝胶微球疫苗实现了多种设计目标，包括通过控制细胞因子释放有效传递基因编辑器，并激活CD103+ CD11b- cDC1s。
为了研究不可逆电穿孔消融可诱导胰腺癌的免疫重构作用，研究人员建立了免疫原位胰腺癌小鼠模型，利用原位胰腺癌小鼠探讨了IRE消融对TME的影响。在IRE治疗7天后，在消融区域发现了明显的肿瘤坏死和胶原纤维，TUNEL染色表明肿瘤区域存在细胞凋亡和潜在的碎片释放。此外RNA-seq数据显示，IRE消融显著改变了胰腺癌的转录组谱，基因集合富集分析（GSEA）显示，在消融治疗后炎症反应、适应性免疫、IFN反应和抗原结合反应显著增强，多种免疫调节基因的水平，包括CD274、Trbc2、Ifng、Gzmb、Flt3lg和CD40lg显著升高。免疫组化（IHC）染色显示，消融诱导的促炎环境促进了CD45的浸润+免疫细胞进入肿瘤区域。（图3a-l）消融治疗后IFN信号通路的过度激活可能导致多基因介导的免疫治疗耐药性和Treg激活的增加，而这通常是通过增加免疫检查点配体或受体的表达而获得的。研究人员设计了一个靶向CD274的小Cas9质粒库，并利用其合成Cas9@lip纳米颗粒，用于装入水凝胶微球疫苗(补充图。结合IRE消融，局部注射水凝胶微球可显著减轻增强促炎免疫微环境，抑制免疫检查点配体PD-L1的表达，促进癌症免疫治疗。（图3m-p）
图2.纳米刀消融对胰腺肿瘤免疫微环境的影响
研究人员随后在小鼠体内对水凝胶微球疫苗对cDC1s招募、激活和迁移作用进行研究。流式细胞术分析显示，水凝胶微球疫苗显著扩增了肿瘤内CD103+ CD11b- cDC1s的比例，且表面CD86和CD40的表达显著增加，树突状细胞主要抑制共刺激因子PD-L1在疫苗刺激后保持较低水平，表明水凝胶微球疫苗对肿瘤驻留的cdc1具有靶向扩增和激活作用。肿瘤内的cDC1需要迁移到T淋巴结以激活肿瘤特异性CD8+ T细胞。流式细胞术分析显示，水凝胶微球疫苗增加了TdLNs和脾脏中总MHC II+ CD11c+细胞的密度，并将CD103+ CD11b- cDC1在总DC中的比例从23.3%提高到60.1%，表明该疫苗增强了肿瘤内CD103+ CD11b- cDC1向TdLNs迁移。与此一致，由于水凝胶微球疫苗刺激了高表达CD40和CD86共刺激分子的CD103+ CD11b- cDC1进入脾脏。这些结果表明水凝胶微球疫苗精确地触发了CD103+ CD11b- cDC1的招募、激活、抗原摄取和迁移到TdLNs的级联过程，从而放大了抗原交叉表达的过程。（图4）
图3.水凝胶对经典1型树突状细胞募集、激活和迁移的活化作用。
cDC1细胞为CD8+ T细胞提供MHC-I/抗原，用于与CD8+ T细胞上的TCR结合形成TCR-MHC-I-抗原复合物，这对于CD8+ T细胞特异性的抗肿瘤免疫至关重要。随后研究人员对水凝胶微球疫苗放大CD8+T细胞的激活和增殖的作用进行研究。流式细胞仪分析显示水凝胶微球疫苗处理的小鼠TdLNS中CD8+T细胞的密度、增殖能力等与对照组小鼠相比显著增加，提示增强的CD103+ CD11b- cDC1级联促进CD8+ T细胞的激活。同时评估了肿瘤浸润性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。IF染色显示，与未接受水凝胶微球疫苗治疗的小鼠相比，接受水凝胶微球疫苗治疗的小鼠肿瘤内CD8+T细胞密度显著增加。流式细胞术分析显示肿瘤内总的CD8+T细胞密度、Ki67+CD8+T细胞密度、IFN-γ+CD8+T细胞密度和Gzmb+CD8+T细胞密度分别比Group1组小鼠高出2.8倍、34倍、7倍和39倍。而肿瘤浸润性FoxP3+CD25+调节性T细胞的密度没有显著变化。另外肿瘤内和血清中IL12p70、IFN-γ和TNF-α的水平显著高于对照组小鼠，且接受局部注射水凝胶疫苗的荷瘤小鼠肝酶天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平没有升高。表明水凝胶微球疫苗安全有效地扩增了CD8+通过扩增cdc1介导的抗原交叉呈递级联反应而获得的T细胞特异性抗肿瘤免疫。然后研究人员评估了IRE消融联合使用水凝胶微球疫苗对胰腺癌的治疗效果。荧光素酶实验表明，在接受水凝胶微球疫苗治疗的肿瘤携带小鼠中，局部肿瘤复发和进展延迟。与单纯进行IRE治疗的小鼠相比，接受水凝胶微球疫苗和IRE联合治疗的KPC肿瘤携带小鼠总体存活期中位数（OS）增加了约30%，而且比未经处理的对照组小鼠增加了近2.5倍（对照组 vs. IRE组 vs. IRE联合水凝胶微球疫苗组：19.0 vs. 36.0 vs. 48.0天，p<0.001）。（图6）
图4. 水凝胶微球疫苗联合IRE消融治疗胰腺癌的疗效。
最后，研究人员评估了水凝胶微球疫苗引发的系统性抗肿瘤免疫反应和远隔效应。与单纯使用IRE治疗的小鼠相比，接受水凝胶微球疫苗和IRE联合治疗的肿瘤携带小鼠循环中MHC II+CD11c+细胞和CD8+T细胞的密度显著增加（图6e-g）。与仅接受IRE单一治疗的小鼠相比，接受水凝胶微球疫苗和IRE联合治疗的小鼠远处皮下转移结节的重量只有其中的五分之一（IRE与疫苗联合治疗的平均重量：0.4860 g vs.0.0980 g，p<0.0001），体积则只有其中的七分之一（IRE与疫苗联合治疗的平均体积：596.0 mm3 vs.87.4 mm3，p<0.0001），表明放大cDC1/CD8+T抗肿瘤轴的策略引发了强大的系统性免疫反应和远隔效应。
研究人员进一步探讨了产生远隔效应的免疫学原理。基于水凝胶微球疫苗的功能，研究人员关注了DCs、巨噬细胞和CD8+T细胞。结果显示在接受IRE联合疫苗治疗的小鼠皮下肿瘤中，IFN-γ+CD8+T细胞的比例显著增加，表明激活的CD8+T细胞可能是远隔效应的原因。随后在具有肺转移和肝转移模型中进行了验证发现远隔效应对于胰腺癌系谱具有很强特异性，而诱导肺部(KL)和肝部(Hepa1-6)癌细胞的远隔转移对局部联合治疗没有反应。此外，研究人员进一步评估了CD8+T细胞耗竭或MHC-I阻断对抗肿瘤远隔效应的影响。单剂腹腔注射抗体药物可以在循环中实现CD8+T细胞耗竭，并阻断浸润到TdLNs中的cDC1s上的MHC-I。结果显示，在经过IRE和水凝胶疫苗治疗皮下肿瘤后，CD8+T细胞耗竭或MHC-I阻断显著促进了远隔皮下转移的生长，表明远隔效应是一种高度靶向CD8+T细胞介导的适应性抗肿瘤效应。
【总结和展望】
综上所述，水凝胶微球疫苗通过促进cDC1介导的免疫级联反应，为有效增强内源性CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫提供了一种策略。与传统的ICB治疗相比，该组合策略也可能成为未来肿瘤内部免疫治疗的新趋势。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-39759-w
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