光敏染料的激发态衰减路径包括辐射跃迁、非辐射跃迁和系间窜越三个部分，为了最大化的让激发态能量以非辐射跃迁的形式回到基态提高光热转化效率，则需要抑制辐射跃迁和系间窜越过程。在光热治疗中，染料激发态的稳定性是激发态调控的基础。在菁类染料中，波长越长其光稳定越差，是由于在光照下被自身产生的ROS导致光敏染料被破坏。此外，基于七甲川菁染料的光热试剂光热效率低，导致治疗过程需要较高的光剂量和光敏剂浓度带来毒副作用，无法实现在安全光剂量和低的光敏剂浓度治疗的目的。因此急需开发具有高稳定性和高光热转换效率的长波长菁染料用于肿瘤治疗。大连理工大学樊江莉/孙文课题组通过在菁染料的共轭骨架中位引入吸电子基团抑制菁染料的辐射跃迁和系间窜越过程，降低染料的电子云密度提高染料光稳定性，同时通过基团和染料骨架之间的单键旋转使得激发态主要以非辐射跃迁的形式回到基态。通过光热协同免疫治疗进一步提高肿瘤的治疗效果（图1）。
图1 （a）七甲川菁染料中位引入吸电子基团设计高光热转换效率光热试剂策略；b）用于指导PTAs设计的简化Jablonski图；c）CF3cy NPs与R848联合用于协同光热免疫治疗示意图
首先，文章设计合成了一类高效激发态调控菁类染料并探究了其光谱/光热性能和机制。
通过光谱测试发现，吸电子基团的引入导致菁染料吸收红移，如图2a所示，Hcy、Ecy、CNcy和CF3cy的吸收波长分别为760、795、819、845 nm。同时猝灭菁染料荧光（图2b）。并且通过理论计算发现，波长红移是由于染料分子的能隙减小（图2c）。随后作者测定了这些化合物的单线态氧产生能力，结果表明改性之后的菁染料单线态氧也减弱。计算结果表明吸电子基团的引入提高了菁染料单重态和三重态的能差抑制系间窜越。因此，作者推测含吸电子基团菁染料激发态能量主要以非辐射跃迁形式回到基态。
图2 (a)中位吸电子基团菁染料归一化吸收光谱、(b)荧光光谱、(c)基于TD-DFT计算中位吸电子基团基态的能隙(ΔEg)
作者为了验证该类菁染料激发态能量主要以非辐射跃迁的形式回到基态进行了超快动力学测试。如图3a所示，单重激发态S1-Sn吸收对应530 nm（Hcy）、555 nm（Ecy）、580 nm（CNcy）和560 nm（CF3cy）处的光诱导吸收（photoinduced absorption, PIA）特征。Hcy（763 nm）、Ecy（796 nm）、CNcy（819 nm）和CF3cy（860 nm）的负吸收与UV-Vis吸收光谱相似，归因于S0-S1基态漂白信号（ground state bleach, GSB）。这两个特征在激光激发后同时出现，从而表明在飞秒激发下以S1状态快速分布。随后这两个特征逐渐衰减，导致S1通过辐射（kr）和非辐射（knr）通道返回基态。除了这两个动力学过程之外，ISC是S1衰减的重要通道。当S1-Sn的PIA特征完全消失时，GSB特征略微保留，并且出现了红带（T1-Tn）中的另一个PIA特征。由于三重态的长寿命，GSB和T1-Tn-PIA特征在纳秒窗口内几乎没有变化，表明仅少数S1种群通过ISC进入T1。通过飞秒超快光谱数据的局部放大图（图3b）发现在纳秒时间尺度下，观察到Hcy的三重态形成而带吸电子基团菁染料均未发现，进一步验证了提出的中位吸电子基团对ISC的抑制。此外，作者还通过理论计算发现吸电子基团与共轭骨架相连的单键可以以极低 的能量进行旋转，并且不会随着角度的改变而发生变化。因此，在Cy7的中间位置引入的EWG通过降低能垒旋转和促进分子内旋转显著增强了PTT效应。
图3 菁染料衍生物在765 nm激光脉冲激发后指定时间延迟处的飞秒瞬态吸收光谱。（a）全局图；（b）局部放大图
然后，作者展示了该类菁染料衍生物在体外的光热升温效果和肿瘤细胞杀伤能力
如图4所示，在体外光热升温曲线图4a-c，不同浓度的菁染料随着光照时间延长温度迅速升高。且光热效率CF3cy>CNcy>Ecy，而空白对照组在同等条件下温度变化较小。作者通过升温降温曲线计算得这些染料PCE分别是54%（Ecy）、62%（CNcy）和83%（CF3cy）。考虑到CF3cy具有更长的波长和光热转化效率，优选CF3cy作为实验分子进行后续生物测试。如图4d-f所示，CF3cy在不同的细胞中均表现出较好的光热杀伤效果同时具有较低的暗毒性。
图4 （a-c）Ecy、CNcy和CF3cy体外光热升温变化趋势。（e-f）Ecy、CNcy和CF3cy细胞毒性评估。
最后，作者将CF3cy制备成纳米材料联合免疫佐剂TLR7/8抑制剂R848用于光热协同免疫治疗肿瘤。
图5（a）治疗方案示意图；（b）免疫细胞激活示意图；（c）和（d）；原位瘤和远端瘤体积变化示意图；（e）树突细胞量化分析；（f）原位瘤和远端瘤T细胞量化分析；（g-j）不同组小鼠血清免疫因子水平分析。1, control. 2, control + light. 3, CF3cy NPs. 4, R848. 5, CF3cy NPs + light. 6, CF3cy NPs + light + R848。
为提高染料的生物相容性和在肿瘤的滞留时间，作者通过制备脂质体将CF3cy包载其中，制备纳米粒子CF3cy NPs用于活体肿瘤治疗。在移植远端瘤24 h后尾静脉注射CF3cy NPs，24 h后用808 nm激光对小鼠的原位肿瘤进行光照。同时在第3、7和10天给小鼠注射免疫佐剂R848（2.5 mg/kg）（图5a），原位治疗的同时记录小鼠双侧肿瘤体积变化。治疗结束后进行分析。联合治疗的机制如图5b所示，纳米粒子和免疫佐剂促进树突细胞和T细胞的成熟分化提高机体免疫水平。该治疗方案不仅可以对原位瘤实现98%的肿瘤抑制率，同时对远端瘤也具有74%的抑制率（图5c-d）。通过流式细胞分析（图5e-f）发现，通过分析树突状细胞的成熟和T细胞标记因子分析其在肿瘤组织的表达情况。相比于空白和空白加光照组以及CF3cy NPs注射未光照组，R848组、CF3cy NPs+light组CF3cy NPs+light+R848组均表现出明显的树突细胞数量增加，分别是对照组的1.43、1.46、1.86倍。此外，分析了不同治疗组的双侧肿瘤中CTL的浸润情况。与对照组相比，CF3cy NPs单一治疗以及R848注射均能刺激原位瘤和远端瘤区域T细胞的富集。更重要的是，联合治疗组原位瘤和远端瘤的CTL的数量分别增加1.98倍和1.88倍，远高于单一治疗方案。通过血清中的免疫因子同样验证了联合治疗的疗效高于单一治疗（图5g-j）。这些结果表明，PTT和R848光热协同免疫治疗可以刺激系统免疫应答促进树突细胞的成熟和T细胞在肿瘤区域的富集以实现光热免疫治疗。
总结
以近红外七甲川菁染料为母体，通过在菁染料共轭骨架的中位引入吸电子基团得到一系列具有高光稳定性和高光热转化效率的光热试剂。弥补了当前长波长菁染料因光稳定性差和低光热转换效率的空白。随着吸电子基团吸电子能力的增强，光热转换效率提高。通过超快动力学实验和理论计算解释了该类分子的激发态调控机制是由吸电子基团和低能垒转子介导的超快非辐射跃迁过程。在该系列菁染料中CF3cy具有最高的光热转换效率（83%）。为设计长波长高光热转换效率菁染料提供指导。最后与免疫佐剂结合后进行光热协同免疫治疗，提高机体免疫水平抑制肿瘤增殖。
转自：“高分子科学前沿”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
