光合微生物作为生物技术的宿主生物越来越受到关注。依靠水、二氧化碳和光作为主要资源，它们的光营养代谢具有很高的潜力，可以实现真正可持续的生产过程。特别是蓝藻已经被研究和讨论作为生产(大宗)化学品的主力，如乙醇，1-丁醇，氢(H2)，甘油。最近，人们研究了光合微生物的氧化还原生物转化，与通过生物催化电子/能量汇与能源利用的直接耦合(即光合光反应)形成生物量相比，其可以更有效地利用光合作用。
加氧酶是光生物催化中一个特别有趣的酶类，因为光合光反应不仅提供还原当量，而且还提供原位O2，克服了异养生物的典型限制，即添加和有效利用还原当量传递的共底物或O2传质。细胞色素P450单加氧酶(CYPs)和Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMOs)已应用于模型菌株Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis)，产生的比活度高达39.2±0.7和60.9 ±1.0 U/gCDW (1 U = 1 μmol/min)对应的体积生产率为2.35±0.04和3.40±0.06 mM/h。
最近几项研究表明，光驱动全细胞氧化还原生物催化的主要限制是:(i)光可用性，(ii)代谢限制和(iii)反应物毒性和抑制。由于光作为驱动异源氧化还原反应和宿主代谢的能量来源，显然必须避免光的限制。在最近一项涉及异种伯克霍尔德菌BVMO的研究表明，光供应不足限制了环己酮(C-1)向ε-己内酯(ε-cl)的(光驱动)转化。但在作者之前的研究中，使用了一种来自食酸菌属的BVMO。然而，CHX100(嗜酸菌)在较大规模(2 L搅拌罐-光生物反应器对mL规模)下获得了2.4倍的高活性，具有与产物相关的效应，而不是光作为决定性限制。因此，产物ε-cl不抑制酶，但导致细胞中毒，从而抑制全细胞生物催化剂。众所周知，这种反应物抑制和毒性会损害生物催化剂的活力和稳定性，无论是在代谢、生理还是酶促水平上。据报道，在胞囊菌中有高活性的还原酶Yqjm，其初始特异性活性高达170 U/gCDW，但产物2-甲基琥珀酰亚胺的毒性可能会阻碍这种反应。作为一种重要的代谢限制，ATP:NADPH比值在氧化还原生物催化过程中会受到电子抽离的干扰。
近日，国际著名期刊Plant Biotechnology Journal
在线发表了题为“Light-driven redox biocatalysis on gram-scale in Synechocystis sp. PCC 6803 via an in vivo cascade”的研究论文，在本研究中，作者阐明了蓝藻体内光合作用驱动级联的能力和局限性。使用一系列方法包括BVMO和内酯酶基因在聚胞菌中的功能共表达，以及从抑制避免、转化率和产物滴度方面对所产生的级联进行评估和优化。证明光驱动生物催化级联操作在蓝藻中的可行性，并强调了各自的代谢限制和工程化目标，以释放光合作用的全部潜力。
到目前为止，应用于蓝藻的酶级联反应通常涉及原生碳固定。蓝藻中酶级联利用非原生底物和光合作用水氧化产生的电子的例子也是罕见的。在这项研究中，作者在集包藻中构建了一个酶级联，将C-1转化为无毒的6-羟基己酸(6-HA)，从而最大限度地减少了反应物对宿主代谢的影响。
作者首先进行BVMO和内酯酶基因的功能共表达。BVMO和内酯酶基因在集包藻Synechocystis中的功能共表达以C-1和ε-cl为底物，用短期活性测定法检测了BVMO:内酯酶的活性。对不同的克隆进行测试，发现在相同的检测条件下以C-1为底物时显示出高达63.1±1.1 U/gCDW (3.1 ±0.1 mM/h)的活性，比用Synechocystis BVMO获得的活性高1.2倍。唯一检测到的产物是6-HA，未检测到中间值ε-cl(图1a)。以ε-cl为底物测定内酯酶活性(图1b)。集包藻Synechocystis BVMO:内酯酶菌株具有极高的特异性内酯酶活性，可达2840±350 U/gCDW (17.6 ±2.1 mM/h)，比已公布的BVMO活性高一个数量级以上。这些结果表明，这两种酶与BVMO的有效偶联是限速的。特别是，高效的ε-cl水解有望在工程化装置中稳定BVMO催化。
图1 以(a)C - 1和(b) ε-Cl为底物的胞囊藻BVMO:内酯酶克隆的比活性。
随后，作者又证明了集包藻Synechocystis的代谢能力似乎限制了氧化还原级联反应。作者在一个2L的光-STR装置中测试了synnechocystis 的BVMO:内酯酶的生物转化性能，该装置在受控的环境和受控的底物供应下提供有效的O2和CO2传质。通过观察这个装置中的C-1转化活性，作者发现光能并不是主要的限制因素。作为生物转化性能下降的一个可能原因，宿主的代谢能力可能变得有限。实际上，在生物转化过程中DOC水平的降低表明光合作用活性降低，因此NADPH供应减少(图3a)。为了研究降低NADPH的代谢负担是否会导致生物转化的稳定，在保持所有其他参数不变的情况下，通过将底物进给量降低到15 U/ gCDW的速率，建立并测试了较低的转化率。发现这些细胞表现出高代谢活性，并且生长情况与未进行生物转化的对照组相当(图3b,c)。
图3 不同生物转化装置内的生物量浓度(紫色)和DOC(蓝色)变化
随后，作者证明了内酯酶是避免ε-cl抑制所必需的。内酯酶的引入能够克服体内BVMO催化反应具有挑战性的动力学所带来的限制。然而，发现这两步级联反应依赖于宿主生物的代谢能力。因此，精细的途径和过程设计可以被认为是成功的光营养代谢代表一个有前途的工程目标的光驱动生物技术的关键。
图4 中等底物投料条件下2L光-STR中光合作用驱动的单酶过程
最后，作者通过能量平衡揭示了未使用的加氧酶催化潜力。作者发现与没有生物转化的对照组相比，当使用匹配10 U/ gCDW的底物时，集包藻在2 L 光-STR中的生长没有受到损害(图3b)。这促使作者在生物转化阶段进行能量/氧化还原平衡，以揭示可以从光合装置中提取多少能量。为此，考虑了入射光量、光合NADPH/还原剂供应和生物质形成和生物转化的电子需求。作者发现在20 U/gCDW光-STR实验的第一个小时内，产物形成的最大量子效率ΦP(0.070)和光对产物效率(1.8%)达到最高，但不能长期维持。当然，随着底物投料的减少，产物形成的量子效率ΦP(0.026)和光对产物效率(0.7%)都降低了，然而，从长期来看，稳定的活性包括底物消耗是持续的。有趣的是，总体量子效率Φtotal也是如此，与对照实验相比，从0.113增加到0.160，但长期来看，随着底物投入量的增加，量子效率大幅下降。
综上所述，作者描述的酶级联构成了一个极好的模型系统，用于研究对强电子汇的生理反应，满足两个重要标准:(i)它是一个可调节的反应，例如，通过底物供应和/或表达强度;(ii)它允许稳定的转化不仅持续数小时，甚至数天。作者描述的利用集包藻synnechocystis sp. PCC 6803中第一个人工光驱动氧化还原级联反应，将环己酮转化为聚合物结构单元6-羟基己酸(6-HA)。来自Acidovorax sp. CHX100的Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)和内酯酶的共表达实现了两步转化，活性高达63.1±1.0 U/gCDW，不积累抑制ε-己内酯。因此，克服了生物催化反应的一个关键限制，即反应物抑制或毒性。在2L搅拌池光生物反应器中，该过程可稳定48 h，形成23.50±0.84 mM (3.11 ±0.12 g/L) 6-HA。高特异性使产物产率(YP/S)达到0.96±0.01 mol/mol，生物催化剂相关产率为3.71±0.21 g6-HA/Gcdw ，说明了在合成级联中产生这种无毒产物的潜力。催化剂上能量负荷的微调是至关重要的，这表明细胞的代谢能力可能受到缺少生物催化相关还原剂的限制。有趣的是，能量平衡揭示了生物转化可以利用光合光反应产生的多余电子，从而减轻光合汇的限制。
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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