1、文献题目
Porphyrin-Containing Metallacage with Precise Active Sites and Super Long-Term Stability as a Specific Peroxidase Mimic for Versatile Analyte Determination
文献期刊：Anal. Chem.
10.1021/acs.analchem.2c03206
2、文献提出的科学问题
氯化血红素在水相中具有明显的聚集倾向，极大地抑制了催化性能。将金属卟啉催化剂固定在各种载体上其产品是异质的，缺乏明确的分子结构。受到金属卟啉在酶促反应中具有活性的事实的启发，含有金属卟啉结构的超分子被认为可能具有类似的行为。
3、分解为几个研究目标
1、基于配位驱动的自组装方法，制备了含金属卟啉纳米笼的仿酶活性催化剂。
2、含Mn(III)的超分子纳米笼(MnPC)在通过各种氧化酶相关反应一步检测H2O2、肌氨酸和葡萄糖中的广泛适用性和方便使用，具有令人满意的检测限和合格的特异性。实际样品包括镜片护理溶液中的H2O2、人尿中的肌氨酸和人血清中的葡萄糖也进行了分析，显示出足够的回收率。
3、含Mn(III)的超分子纳米笼的固有电子结构赋予了电化学检测H2O2和葡萄糖的能力。
4、研究总体方案
纳米笼是通过配位驱动的自组装过程制备的，并且发现基于Mn(III)卟啉的纳米笼在pH 6.0时仅具有过氧化物酶样活性，而在常规条件下既没有氧化酶也没有过氧化氢酶样活性。含Mn(III)的超分子纳米笼(MnPC)在通过各种氧化酶相关反应一步检测H2O2、肌氨酸和葡萄糖中的广泛适用性和方便使用，具有令人满意的检测限和合格的特异性。
5、方法和技术手段
SEM、TEM、1H NMR、ESR、UV-vis、 Fluorescent spectra
6、主要研究成果
1、基于配位驱动的自组装方法，将5，10，15，20-四(3-吡啶基)卟吩(PM)、锌5，10，15，20-四(3-吡啶基)-21H，23H-卟吩(Zn-PM)或锰5，10，15，20-四(3-吡啶基)卟吩(Mn-PM)与120°的二铂(II)配体(Pt-L)在DMSO中于80℃混合10分钟。三种配体(Pt-L、PM和Zn-PM)和三种笼(PC、ZnPC和Mn-PC)的质子核磁共振(1 H NMR)光谱中对于PC和ZnPC，由于氮原子和Pt(II)中心的配位，吡啶基上质子的信号在1 H NMR谱中下移，吡咯在PC中的信号上移。PC、Zn-PC和Mn-PC的所有31P核磁共振谱都呈现出一个单峰，并伴随着195Pt卫星峰(PC的δ = 12.63 ppm，Zn-PC的δ= 12.73 ppm，Mn-PC的δ= 12.75 ppm)，表明获得了单一成分。与Pt-L相比，PC、Zn-PC和Mn-PC的这些峰显示出约6.29、6.18和6.17 ppm的上场位移。ESI-MS被认为是确定所获得的组装体的分子形成的有效方法。由于三氟甲磺酸反离子的损失数量不同，PC、ZnPC和Mn-PC的ESI-MS谱都表现出一组具有不同电荷态的峰。解卷积后，这三个金属配合物的分子量分别为6597.5 Da (PC)、6721.3 Da (Zn-PC)和6821.3 Da (Mn-PC)，与它们预期的两个卟啉和四个二铂(II)配体(Pt-L)的化学组成很好地匹配。NMR和ESI-MS表征可以轻松确保所有产物的形成，与同步加速器表征相比，不需要那么费时费力。Mn-PC的高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)图像显示了尺寸为2.5 nm的分散良好的纳米颗粒，与从2D扩散有序光谱(DOSY)光谱获得的2.2 nm的PC一致。
2、与PC、Zn-PC、Pt-L和Mn-PM(Mn-PC的结构单元)以及Pt-L和Mn-PM的混合物相比，尽管Mn-PC的浓度是PC和Zn-PC的一半，但是只有Mn-PC表现出明显的POD-样活性。可能的原因是:(i) PC没有价态可变的金属原子；(II)Zn-PC中的Zn原子是氧化还原惰性的，就像用Zn(II)置换Mn(II)产生抗氧化的无效性一样；(iii)纳米笼结构在它们的酶模拟功能中具有金属卟啉络合物的独创性。当与分别具有OXD-和CAT活性的Pt NP和Pd @ Pt NPs相比时，Mn-PC的这种特征性结构的巧妙性也通过作为POD模拟物的特异性得到证实。这与单原子催化剂（如同时表现出POD、OXD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶活性的Fe-N/C）以及原子分散的Mn（可能由于配位环境的细微差别，Mn在催化氧还原和水氧化方面具有不同的性能）形成了鲜明的对比。Mn-PC的POD-活性还表现在对其他发色底物的催化氧化上，如OPD和ABTS。特异的POD-样活性解除了O2的干扰，避免了O2直接氧化底物为其显色产物，同时揭示了结构特异性关系，这有助于纳米酶的设计。在没有TMB的情况下，Mn-PC与H2O2的孵育可导致卟啉配体外围的降解，降低Mn-PC在462 nm的固有吸光度。这也解释了Mn-PC在240 nm处的吸光度下降14.5%。尽管如此，Mn-PC受到TMB的“保护”,它将与H2O2反应，Mn-PC在462 nm处的吸光度将被恢复，对于Mn-PM观察到类似的情况。
3、为了验证该反应是否与活性氧(ROS)有关，硫脲被用作ROS的清除剂。硫脲的存在可以减少TMB、H2O2和Mn-PC的反应混合物的特征吸光度，该特征吸光度随着硫脲浓度的增加而逐渐减弱，并且在0.5 mM硫脲下完全消失，这表明硫脲消除了产生的ROS。ROS的产生具有浓度依赖性，因为在0.04 mM和0.1 mM的固定硫脲浓度下，吸光度随着Mn-PC浓度的增加而增强。为了确定活性氧的种类，采用了ESR光谱，并采用DMPO作为可能产生的羟基自由基(·OH)的捕获剂。当与Mn-PC和H2O2一起孵育时，DMPO可以与OH反应生成DMPO/OH的羟基自由基加合物，这可以通过强度比为1:2:2:1的特征四重峰模式得到证实。因此，涉及OH的机理可以得到验证。在pH值和温度的优化中，发现最佳值为25℃ pH = 6。当pH低于6时，质子化的TMB47与Mn-PC具有静电排斥作用，并且这种质子化作用随着pH的增加而减弱，这可以通过ζ电势测试来验证。如果没有特别提到，我们在所有后续实验中采用25°C的温度。40分钟后，反应达到平稳状态。利用TMB的显色氧化来优化反应物的浓度，其中Mn-PC的浓度首先用固定浓度的TMB和H2O2来优化。吸光度最大值出现在浓度为50 μg/mL时。同样，通过改变TMB或H2O2的浓度来分析稳态动力学，根据双倒数图计算Michaelis常数(Km)、酶对底物的亲和力和最大反应速率(Vm)，Mn-PC的Km值与其他人工酶相当，甚至更低，包括原子级分散的锌或铁纳米酶。当考虑H2O2作为底物时，Vm也与锌基卟啉样结构的Vm相当，Fe-N-C甚至高于HRP的Vm，表明Mn-PC有资格作为POD模拟物。Kcat值通常代表单个酶活性位点的最大周转率。鉴于基于NP的纳米酶具有大量活性位点或金属原子的事实，在评估活性位点的活性或从原子经济性的角度来看，每个单个活性位点或金属原子的Kcat应该更合理。在这项研究中，该值可以通过精确的计算稳定地获得，而不是依赖于要求纳米粒子单分散的纳米粒子跟踪分析系统来估计基于纳米粒子的纳米酶。
4、选择H2O2和肌氨酸作为目标模型，使用TMB作为显色底物便于检测。在pH = 6, 25℃为Mn-PC检测H2O2的最佳条件，检测范围为0.01 ~ 1.0 mM，检出限为1.9 μM。护理溶液中H2O2的真实样品也通过该分析来测定。回收率在95.85−104.6%之间。值得注意的是，Mn-PC的催化活性非常持久，即使在545天后也能保持原有的性能。这一特点体现在H2O2的检测结果几乎没有变化。据推测，优异的稳定性源于纳米笼的限制，这是一种常用的方法来调节光源或染料周围的环境，以避免因聚集而导致的猝灭同样，约束有效地阻止了活性锰卟啉单元的聚集;否则，Mn-PC本身很容易在反应介质中发生聚集，导致催化活性大大降低。肌氨酸的检测是通过将肌氨酸转化为H2O2的索氏过程，以及Mn-PC催化的氧化反应，将肌氨酸水平转化为比色信号来实现的。为了获得最佳pH值，在两个过程中尝试了不同的pH值，并确定6.5的pH值为最佳条件，在此条件下实现了方便的一步检测策略。在20 ~ 300 μM范围内，肌氨酸浓度与652 nm处吸光度值呈线性关系，检出限为2.3 μM，低于两步检测法的检出限(4.9 μM)，说明了该方法的合理性。几种背景物质包括抗坏血酸、葡萄糖、甘氨酸、半胱氨酸和尿素，被用来研究这种测定的选择性。即使它们的浓度(5 mM)比肌氨酸(1 mM)高4倍，也不会干扰检测过程，表明它们具有良好的选择性。为了证明这种生物传感器在实际应用中的可行性，我们对4%的人类尿液样本进行了肌氨酸的分析。标准加入法回收率在100.4 ~ 104.8%范围内，验证了该方法适用于实际样品中肌氨酸的测定。
5、Mn-PC在生物分析中具有广泛的适用性。为了验证这一点，对葡萄糖进行了一步和两步检测。众所周知，天然葡萄糖氧化酶的最适pH值为5.5.53，因此，在一步检测中采用了折衷的pH值6.0，线性范围为0.05-1.0mM，检测限为43.0微米。两步检测显示线性范围为0.02至1.5毫米，检测限为19.4微米。选择可能的干扰物质(包括果糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖)来评估选择性，产生可忽略的信号。Mn-PC的抗干扰能力也通过在分析加标0.5%血清样品时令人满意的回收率得到了验证。除了光谱化学检测之外，由于Mn-PC的组成电子结构保持了总电导率，还实现了H2O2和葡萄糖的电化学检测。还原电流随着H2O2浓度的增加而增加，并在0.45 V、0.1至10 mM范围内呈现完美的线性。相反，由于葡萄糖氧化过程中O2的消耗，阴极电流随着葡萄糖浓度的增加而降低，这与之前报告的结果一致。获得了0.1至1 mM的线性范围。在4°C下储存1个月后，修饰电极表现出优异的稳定性，电流没有减少。此外，当在葡萄糖检测过程中加入10倍浓度的干扰物时，再次产生类似的电流变化趋势，表明这种电化学生物传感器的抗干扰性能。
7、作者给出结论
1、金属卟啉和许多天然酶的活性中心之间的相似性给了我们设计Mn-PC结构的仿生含义。它继承了单原子和MOF基纳米酶最大限度利用金属原子的优点，同时在分子结构明确、易于表征和产率高等方面具有独特的优势。这有助于精确计算实际意义上的每个活性位点的Kcat值。
2、金属原子的超相容微环境赋予Mn-PC超长期稳定性和独有的类POD-活性，而非类OXD或类CAT活性。对 POD 活性来源的详细研究，包括羟基自由基清除试验和 ESR 光谱分析，确保了羟自由基参与的机制，在这种机制下，无需热或光辐射等任何其他刺激，就会发生比色反应。
3、通过一步法建立了H2O2、肌氨酸和葡萄糖的比色生物传感器，其检测过程方便，检测限分别为1.9、2.3和43.0 μM。同时，还演示了葡萄糖和H2O2的电化学检测。它通过超分子自组装将单个分散的活性位点定位在一致的微环境中，为纳米酶提供了一种新的设计理念，超分子自组装的结构可以通过合理设计超分子构型来简单地调整和改变。
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