标题
西藏来源的植物内生酵母Wickerhamomyces rabaulensis生产γ-氨基丁酸
作者
范婷婷，王淇，王慕瑶，孙梦林，曾杜文，章漳，李俊，赵心清
摘要
【目的】对西藏地区分离的一株植物内生维克汉姆酵母Wickerhamomyces rabaulensis JT229生产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的条件进行研究，并考察胁迫处理对生产的影响。【方法】利用26S rDNA序列进行菌株鉴定，考察葡萄糖和木糖对W. rabaulensis JT229生产GABA的影响，并利用添加乙酸、乙醇和高温等胁迫条件提升其发酵生产GABA的能力。【结果】W. rabaulensis JT229可以利用葡萄糖和木糖生产GABA，并且在适当的高温、乙酸和乙醇的胁迫诱导下胞外GABA浓度明显提升，产量分别为80.07、67.02、104.15 mg/L，分别是对照条件下的2.15、1.85和2.87倍，且胞内也检测到存在一定浓度的GABA。在添加5 g/L乙酸和37 °C高温胁迫的条件下，胞内ROS水平和细胞膜透性均有明显提高；添加3 g/L乙酸的条件与对照组相比，胞内ROS水平有所下降，但是细胞膜透性有明显提升；在37 °C的胁迫条件下胞内GABA含量明显下降。胞外的GABA产量提升推测是由于胁迫导致胞内GABA外排增多导致的。【结论】本研究首次在国内外分离鉴定了内生酵母W. rabaulensis，并发现菌株W. rabaulensis JT229具有生产GABA的潜力，此外，利用胁迫处理促进了该菌株的GABA胞外生产，为进一步开发利用酵母资源生产GABA及富含GABA的产品提供了基础。
西藏自治区地处我国西部边远地区，具有非常独特的地理环境，比如强紫外辐射、高海拔、低温、氧气匮乏等，当地独特的地理环境可能蕴含着特殊的微生物资源。早期研究者对西藏地区微生物的研究大多集中在湿地微生物、藏式酸奶、青稞酒曲以及用于藏药的微生物[1-2]。近年来，很多研究者从西藏地区分离耐冷酵母用于生物防治[3-4]或者去除水中的重金属[5]。但是，目前对西藏地区野生来源的内生酵母的应用研究还比较少。
植物表面和内部都附着很多细菌或真菌。内生菌(endophytes)在多种植物中普遍存在，包括真菌、细菌和放线菌等，并呈现寄生和共生等多种生活方式[6]。对内生菌的研究和开发不仅可以丰富自然界的微生物资源，还可以了解内生菌与其植物宿主的相互作用[7]，也可以用于天然药物和其他活性物质的研发中，为其提供新思路和新的菌株资源[8-10]。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一种天然存在的四碳非蛋白质氨基酸，广泛存在于植物、动物以及微生物体内。GABA在人体内是一种抑制性神经递质，主要活性是调节突触传递、放松神经从而发挥助眠以及抗抑郁的作用[11]，另外还具有抗高血压、抗糖尿病以及抗癌的作用[12]。GABA的市场应用非常广泛，可以被添加到很多助眠药物以及保健品中；也可以添加到畜禽的饲料中，具有促生长和抗应激的作用[13]；还可以作为护肤品的主要成分，具有平复皱纹的作用[14]。但是，目前还未见报道从植物内生菌中分离得到GABA生产菌。
目前GABA的产生途径主要有微生物合成、植物提取以及化学合成等。化学合成和植物提取分别以环境污染和产量低为主要限制[15]，因此微生物发酵法合成GABA是目前主要的研究方向。目前文献报道有一些酵母可以合成GABA，包括马克斯克鲁维酵母等在内的多种非常规酵母菌株[14,16-19]。非常规酵母具有耐性强、可以利用生物质来源的多种碳源、可生产多种活性物质等优点[20]，因此，探究更多可生产GABA的非常规酵母菌株，有利于更好利用酵母资源和生物质资源进行生物炼制，实现可持续发展[21]。
维克汉姆酵母(Wickerhamomyces rabaulensis)原来命名为Pichia rabaulensis，模式菌株分离于蜗牛的分泌物[22]，目前对其生物技术应用研究非常有限，研究报道从腐木分离的W. rabaulensis菌株可在甘蔗渣半纤维素水解物中利用木糖生产乙醇[23]和木糖醇[24]。但是，目前国内外还没有将酵母W. rabaulensis作为微生物细胞工厂生产GABA以及相关活性化合物的研究报道。
本研究发现从西藏采集的姜果实内部分离的W. rabaulensis酵母菌株可以生产GABA，并探究了利用胁迫刺激促进其生产GABA的方法，为利用维克酵母生产GABA和富含GABA的产品提供了新的策略。此外，本研究也是首次报道分离获得植物内生W. rabaulensis菌株，为进一步开发利用相关非常规酵母资源提供了基础。
1 材料与方法
1.1 实验菌株和培养方法
本研究所用酵母菌株分离自2019年10月，分离样本为西藏林芝地区的野生姜果实。该菌株已于2021年4月在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No. 2.6477。在YPD培养基培养酵母菌株，YPD培养基组成为：10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖，配制固体培养基时加入20 g/L琼脂粉，1×105 Pa灭菌20 min。
1.2 菌种鉴定
YPD固体培养基上长出肉眼清晰可见的酵母菌落后，在光学显微镜下观察细胞形态。粗提酵母基因组，使用26S rRNA D1/D2区域通用引物26S-F (5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3′)和26S-R (5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)进行PCR扩增，产物由上海擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库(http://blas-t.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列相似性比对。
1.3 菌株耐温性能检测
取20 μL于–80 °C保存的菌液接种到1 mL YPD液体培养基中，于25 °C摇床中培养24 h，取50 μL接种到5 mL 新鲜YPD液体培养基上培养12 h，将菌液进行梯度稀释，依次取2 μL点至YPD固体培养基上，将平板分别置于4、8、20、23、25、28、30和37 °C培养箱中倒置培养，拍照并观察菌株的生长状况。
1.4 菌株发酵生产GABA和胁迫条件处理
将保存的菌液从–80 °C冰箱取出，取50 μL接种到5 mL YPD液体培养基中，于25 °C、200 r/min摇床中培养24 h后转接到100 mL YPD种子培养基中，置于25 °C摇床中培养17–18 h，按照初始细胞密度OD600为0.1接种到YPD发酵培养基中，用透气封口膜封口，在25 °C、200 r/min培养条件下发酵。外源添加乙醇和乙酸时分别按照乙醇3%和5%、乙酸3 g/L和5 g/L的比例在接种之前加入，放于25 °C摇床培养。
1.5 胞外GABA浓度检测
在发酵24 h时取样1 mL，在8 000 r/min条件下离心3 min，取上清液20 μL稀释50倍至 1 mL，混匀过0.22 μm滤膜，用超高效液相色谱-四极杆质谱仪测定GABA的含量。流动相：A：0.1%甲酸-水，B：乙腈；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm× 100 mm；温度：35 °C；进样体积：2 μL；流速：0.25 mL/min。GABA的出峰时间为1.010 min。
1.6 胞内GABA含量检测
发酵24 h后取样50 mL，于4 °C下离心收集菌体，用无菌去离子水洗涤2次，加入0.1 mol/L盐酸溶液和玻璃珠，用细胞破碎仪破碎细胞，随后收集所有上清液并加入适量体积的磺基水杨酸，在4 °C静置1 h，在4 °C下离心30 min后收集上清液，调pH为1.9，经0.22 μm滤膜过滤后，用全自动氨基酸分析仪检测GABA的含量，同时测相同干重的细胞用于计算最终含量。
1.7 胞内ROS检测
使用活性氧试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)的方法检测。
1.8 细胞膜透性检测
采用文献[25]的方法并进行改进，取发酵24 h的细胞1 OD600，用PBS缓冲液洗2遍，用稀释后的PI染液悬浮细胞，置于黑暗中孵育20 min，每5 min上下颠倒混匀1次，随后用PBS缓冲液洗2遍，用多功能酶标仪在513 nm激发光和617 nm发射光条件下测定荧光值，以空白PBS的荧光值作为对照。利用荧光值与相应的OD600值进行计算，“(样品荧光值–PBS荧光值)/OD600”即为细胞膜透性。
2 结果与分析
2.1 W. rabaulensis JT229的筛选及其耐温性
利用文献[26]报道的显色反应对本实验室分离鉴定的酵母菌株进行筛选，发现W. rabaulensis具有GABA生产能力。该菌株分离自西藏林芝地区的姜果实样品内部，将该菌株编号为JT229。为了探究该菌株的最适生长温度，对该菌株进行不同温度条件下平板上生长的测定，结果表明，W. rabaulensis JT229的最适生长温度为25 °C，耐低温性较强，在4 °C和8 °C下均能生长；该菌株耐高温性能相对较差，在30 °C条件下生长能力稍减弱，在37 °C下生长明显被抑制(图1)。有研究表明，青藏高原酵母类种群多数属于耐低温酵母[27]，这可能与西藏地区独特的低温环境相关。
2.2 W. rabaulensis JT229胞外GABA的产量
2.2.1 菌株利用葡萄糖和木糖生产GABA
W. rabaulensis JT229可以在YPD培养基中利用葡萄糖生产GABA，已知一株W. rabaulensis酵母在甘蔗渣半纤维素水解物中可利用木糖生产乙醇[23]，因此本研究测试了菌株在30 °C下以不同浓度的葡萄糖和木糖为碳源的YPD和YPX培养基中的GABA生产情况，结果如图2所示。菌株以葡萄糖为碳源时，生长和GABA的产量均无显著差异(图2A、2C)。菌株以不同浓度的木糖作为碳源条件下的生长无差别，并且可以利用木糖作为碳源生产GABA，产量也无明显差别(图2B、2D)，说明该菌株具有利用秸秆水解液中的木糖进行GABA生产的潜力。此外，考察了利用混合糖发酵生产GABA的能力，但混合糖未能促进菌株更好的生产GABA (结果未显示)。考虑到较低浓度的葡萄糖就可以产生较高浓度的GABA，因此选用20 g/L葡萄糖作为单一碳源进行后续的实验探究。
图1 Wickerhanomyces rabaulensis JT229在不同温度条件下的生长
图2 Wickerhanomyces rabaulensis JT229利用葡萄糖和木糖为碳源的生长(A、B)和GABA生产(C、D)
2.2.2 利用胁迫条件诱导生产GABA
GABA作为一种胁迫保护剂可以提高菌株的胁迫耐受性[28]，推测利用人为施加的胁迫条件，可以促使菌株更多地生产GABA，因此本研究进行了胁迫驱动的GABA生产探究。由于本课题组长期从事木质纤维素类生物质的生物炼制研究，因此围绕相关的胁迫开展了探究，高温是发酵生产中常见的胁迫，乙醇是酵母常见的毒性发酵产物，乙酸是秸秆水解液中普遍存在的抑制性物质[29]，因此选择了这3个胁迫条件进行探究。
首先以25 °C作为对照培养条件，考察了30 °C和37 °C作为不同高温的胁迫条件对GABA生产的影响。结果表明，在30 °C和37 °C下，菌株生长受到抑制，尤其是在37 °C下，菌株几乎不生长(图3A)，但在几乎不生长的37 °C下更有利于胞外GABA的产生，达到80.07 mg/L，是对照条件下产量37.27 mg/L的2.15倍(图3C)。该菌株对于乙酸的耐受性较差，在添加乙酸的条件下前24 h均不能生长，其中在添加5 g/L乙酸的条件下，菌株几乎无生长能力；添加3 g/L乙酸的菌株在24 h后迅速生长。菌株对于乙醇的耐受性强于乙酸，在3%和5%的乙醇浓度下可以生长(图3B)。对于GABA的生产情况，乙酸促进胞外GABA产量的提升更明显，并且3 g/L和5 g/L的促进作用差别不大，分别为92.49 mg/L和104.15 mg/L，为对照条件36.31 mg/L的2.55倍和2.87倍；乙醇对胞外GABA的生产也有一定的诱导效果，分别为40.57 mg/L 和67.02 mg/L，为对照条件的1.12倍和1.85倍(图3D)。酵母细胞在低浓度的乙酸中，可以将乙酸转化为乙酰辅酶A后参与TCA循环以维持细胞的生长和代谢[30]，但是本研究菌株在24 h内几乎无生长，因此推测乙酸并未被吸收利用。酵母细胞在受到乙酸胁迫时，其细胞膜和细胞壁的完整性、流动性以及质膜成分都会发生变化，因此推测胞外GABA产量提高是由于乙酸胁迫导致质膜变化引起的[31]。
图3 Wickerhanomyces rabaulensis JT229在胁迫条件下的生长(A、B)和GABA生产(C、D)
由图3可看出，高温、乙醇和乙酸胁迫均能促进GABA的产生，且在本研究中的几个条件下最有效的是5 g/L乙酸的诱导。另外，同一条件下不同程度的胁迫对促进胞外GABA的产生都有促进作用，且在一定范围内胞外GABA含量与胁迫程度成正比。但是GABA的产量并不与菌株的生长状况成正比，而是在一定程度下，菌株生长受到抑制的条件更有利于GABA的产生。由于GABA是胁迫保护物质，因此我们推测胁迫条件下有可能GABA的合成提高，或者由于胁迫导致细胞膜损伤，GABA的外排增多。此外，在胁迫过高的情况下并不能达到更好地诱导产GABA的效果，反而使胞外GABA含量有所下降。
2.3 W. rabaulensis JT229在胁迫条件下胞内ROS和细胞膜透性的变化
细胞在受到外部胁迫条件的诱导时会使胞内ROS水平升高[32]，从而产生大量的胁迫保护性的物质例如GABA，以应对胞内ROS水平的升高，并且细胞在受到胁迫刺激时可能使细胞膜透性提高，促进GABA的释放。为了验证这一猜想，本研究检测了在GABA产量较高的3个条件下的胞内ROS的积累和细胞膜透性，结果如图4所示。在添加5 g/L乙酸和37 °C高温的条件下，胞内ROS水平和细胞膜透性均有明显提高，其中添加5 g/L乙酸的条件下胞内ROS是对照条件下的10.05倍，细胞膜透性是对照条件下的2 223.62倍。添加3 g/L乙酸的条件与对照组相比，胞内ROS水平有所下降，但是细胞膜透性有明显提升，是对照组的9.80倍。由此可见，胁迫条件下该酵母的胞内ROS水平高不一定引起细胞膜透性的提高。
2.4 W. rabaulensis JT229在胁迫条件下胞内氨基酸的积累
为了探究胞内GABA以及其他氨基酸的变化情况，检测了乙酸和高温胁迫2个条件下的胞内氨基酸的含量，结果如图5所示。由于菌株在乙醇添加条件下的GABA产量提升不明显，因此未对添加乙醇条件下的胞内GABA进行探究。GABA在细胞的生命活动中具有吸收和外排的途径，且大部分积累在胞内[33]，本研究结果表明对照和胁迫条件下的细胞内确实蕴含着大量GABA，3 g/L的乙酸诱导与对照条件下的胞内GABA含量几乎无差别，分别为1 766.72 mg/g干重和1 824.45 mg/g干重；且37 °C高温诱导下的胞内GABA含量(492.47 mg/g干重)明显低于对照组(图5A)。谷氨酸是GABA合成的前体[18]，在胁迫条件下，谷氨酸含量无发现下降，反而在高温条件下有所提高，因此推测，胞外GABA含量提高不是由于胞内GABA合成提高造成的。我们推测若胁迫条件下胞内的GABA合成增多，则其前体谷氨酸的含量应下降，但本研究结果显示谷氨酸在2个胁迫条件下的含量均高于对照，因此胁迫条件下胞内可能没有合成更多的GABA。另外发现，高温和乙酸胁迫条件下多个氨基酸都没有很显著变化，只有高温条件下丙氨酸明显上调(图5A、5B)，具体机制还不清楚。结合图4细胞膜的通透性结果，我们推测2种胁迫条件下胞外GABA产量提高的原因是由于胁迫条件导致细胞膜透性提高，胞内GABA更多的排出到胞外。
图4 胁迫条件下Wickerhanomyces rabaulensis JT229的胞内ROS和细胞膜透性
3 讨论
本研究首次发现一株分离自西藏姜果实的非常规酵母W. rabaulensis具有生产GABA的潜力， 还发现该菌株具有比较好的木糖利用性能。木糖是木质纤维素生物质中含量除了葡萄糖外最丰富的糖[34]，本研究分离的菌株具有可利用廉价可再生生物质资源进行高值产品GABA生产的能力。木质纤维素水解液中经常含有多种抑制物，其中乙酸是含量比较高的抑制物，来自于半纤维素的乙酰基，普遍存在于多种水解液中，该抑制物的存在会严重影响酵母的生长和发酵能力[35-36]。但本研究发现W. rabaulensis JT229可以在乙酸的胁迫下生产GABA，提示含有抑制物的秸秆水解液可能更有利于一些活性物质的生产。
图5 胁迫条件下Wickerhanomyces rabaulensis JT229的胞内氨基酸含量
前期研究多集中在胞外GABA的生产，对胞内的研究很少。本研究探究了胞外和胞内GABA的产量，证明维克汉姆酵母胞内也存在较多的GABA，为利用其他酵母和相关微生物生产GABA和类似的胁迫保护物质提供了新的思路。此外，本研究还发现GABA在胞内也有比较高的积累，可以通过细胞破壁、高温或乙醇提取等方法对胞内GABA进行提取，则可以实现GABA胞内外总量的获得。另外，值得注意的是，国内的一些文献使用显色法检测GABA的含量，本实验室前期验证结果表明，此方法的误差较大，而本研究使用UPLC-MS检测GABA的含量具有高度的精确性。
酵母菌具有生产多种活性物质的潜力，例如产生细胞壁多糖、多肽和多种氨基酸等物质[20]，因此，生产GABA的酵母可以和其他活性物质联合生产，提高综合利用价值。另外，利用可生产GABA的酵母也可生产功能食品，比如文献报道用产GABA的酵母酿造富含GABA的果酒和奶酪等[37-38]。本研究分离的酵母来自姜果实，后续可进一步探究该菌株在GABA和其他活性物质联产，以及在食品和化妆品等生产领域的更多应用。
内生酵母目前的研究多集中在其与植物的相互作用、对植物抗逆性的促进作用以及药用价值的探索等[9]，内生酵母的应用相关研究还比较有限。本研究对分离自西藏姜果实的内生酵母生产GABA的菌株进行了研究，后续可以进一步优化发酵条件，或者利用遗传改造进一步提高菌株的性能，还可以挖掘其关键酶基因和调控基因，有希望进一步提高GABA产量。值得指出的是，目前对维克汉姆酵母(W. rabaulensis)的应用研究非常少，本研究为国内外首次报道该菌种能够生产GABA，为进一步开发利用维克汉姆酵母和其他更多的非常规酵母资源提供了借鉴。
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