导言
细胞外囊泡（EVs）是一种纳米级颗粒，用于在生物体之间传递 RNA、蛋白质和代谢产物等生物材料。EVs 作为细胞间通信的一种形式，被广泛发现在各个生命界中。最近对植物-病原体界面的研究表明，植物产生和分泌 EVs，将小 RNA 运输到病原体细胞中，从而静默与病原性相关的基因。细菌和真菌等与植物相互作用的微生物也分泌 EVs，将蛋白质、代谢产物和潜在的 RNA 运输到植物细胞中，增强它们的病原性。本综述重点介绍了植物-病原体相互作用中 EVs 介导通讯的最新进展，强调了 EVs 在跨界 RNA干扰中的作用。
正文
20 世纪中叶，EVs 首次在植物和哺乳动物中被观察到，比人们意识到这些囊泡是一种普遍存在且具有重要影响力的细胞间和生物体间通信形式要早了半个世纪。第一个关于哺乳动物细胞外囊泡的观察是在 1946 年发现了人类血浆中的血小板来源颗粒。1965 年，在棉花植物中首次观察到多囊体内腔囊泡。随后在胡萝卜中观察到多囊体能够与质膜融合，释放囊泡到细胞外隙，从而发现了植物 EVs。EVs 在细胞间传递这些生物分子，对细胞间通信起着重要作用。此外，EVs 还被认为是重要的疾病生物标志物，并具有治疗和诊断的潜在应用。
研究植物和微生物 EVs 相比于哺乳动物系统的研究进展较慢，这是由于细胞外囊泡的分离和检测方法的局限性。哺乳动物 EVs 经常从细胞培养物或体液（如血液、母乳、尿液、肺液和精液）中分离出来，这些哺乳动物样本是液体，所以提取相对简单。相比之下，从植物中提取 EVs 更具挑战性，这是由于细胞外液体量较少，并且在植物中进行 EVs 分离所需的步骤较为复杂。
最近，研究成功地从植物的叶片、根部和种子的细胞外空隙液中分离出了植物 EVs。研究对不同类别的植物 EVs、蛋白标记物和脂质组成进行表征，与对哺乳动物 EVs 的表征工作相呼应。新兴证据表明，植物 EVs 在植物小RNAs（sRNAs）跨界进入真菌细胞以沉默与病原相关的基因方面发挥着重要作用。这种现象被称为"跨界 RNA 干扰"，能够进行 RNA 交换的广泛生物范围凸显了研究 RNA 转位机制以及 EVs 在这些相互作用中潜在作用的重要性。最近的研究还表明，在细菌、真菌和卵菌等寄生植物微生物感染植物时，EVs 可能通过向植物寄主细胞传递蛋白质、RNA 和代谢产物来在病原体中发挥突出的致病作用（图1）。
图1. 植物-微生物相互作用中的跨界 RNA 干扰
植物细胞外囊泡
EVs 能够保护其生物载体免受胞外环境中丰富的核酸酶和蛋白酶的影响。EVs 介导的运输是 RNA 传输的主要途径之一。哺乳动物 EVs 可以从生物液体或培养上清中分离出来。同样，植物 EVs 可以从细胞外质腔洗涤液和细胞培养基等多种来源中分离出来。在诸如棉花、胡萝卜、水稻等众多植物物种中观察到了 EVs，并且已从拟南芥、向日葵、橄榄和苦烟等中分离出来（图2）。在植物中已经分离出了异质的 EV 亚群，可能具有不同的功能。在拟南芥中，报道了五种 EV 亚型，它们通过不同的蛋白标记、大小和/或生物发生起源进行分离和/或表征，如图2所示。
图2. 植物中分离的异质性 EVs 种群
值得注意的是，并非所有植物衍生的囊泡都是 EVs。EVs 是在植物的细胞外隙自然分泌的特异性囊泡，具有独特的生物标志物和细胞功能。以前，从葡萄、西兰花、姜和葡萄柚的破碎或均质化组织中收集的囊泡被称为纳米囊泡。然而，这些纳米囊泡并不是真正的 EVs，因为它们并不自然存在于细胞外隙。尽管如此，植物纳米囊泡在生物医学中具有应用价值，因为它们可以保护和输送药物、RNA 和蛋白质等生物化合物进入靶细胞。植物纳米囊泡在人类和小鼠中起到预防炎症和肠道通透性的作用，并影响肠道菌群。植物纳米囊泡和 EVs 具有不同的尺寸分布：EVs 范围从 60 到 200 纳米，纳米囊泡范围从 100 到 300 纳米。癌细胞对这两种类型的囊泡吸收效率很高，尽管 EVs 的吸收率几乎是植物纳米囊泡的三倍。这个结果突显了植物衍生囊泡的功能多样性，证明植物 EVs 在治疗递送方面具有潜在应用价值。
常用的植物细胞外囊泡提取方法
对于哺乳动物细胞，可以使用差速离心从细胞外液中分离出不同密度范围的 EVs。例如，低速离心（2000 × g左右）可有效恢复大囊泡或凋亡小体等细胞片段。中尺寸 EVs，如微囊泡，可以在 10,000-20,000 × g 左右离心收集。小的 EVs，主要是外泌体，需要超过 100,000 × g (P100) 的高速超离心才能成功回收。使用不同的超离心速度进行植物 EVs 分离，是对不同大小、密度和载货量的不同类型 EVs 的发现和表征的补充。
在不同的离心速度以及萃取方法中，细胞外洗涤液的提取方法差异对不同 EVs 或非囊泡成分的收集有极大的影响。通过整株植物方法收集的细胞外洗涤液相比于从离体叶片中提取的细胞外洗涤液，含有更多的细胞碎片和细胞质成分的污染物。相比之下，离体叶片法在 EVs 制备中几乎没有 Rubisco 蛋白的污染。重要的是不仅要考虑萃取方法，还有影响 EVs 载体以及与 EVs 共沉淀的非囊泡成分的植物病害或胁迫条件。不同的方法可能只捕获不同子集的 EVs，因此基于单个方法对所有植物 EVs 亚型的功能进行概括是不合适的。离心分离结合梯度离心可以提高分离的 EVs 质量并减少污染物，差速离心、蔗糖梯度和浮力密度梯度也可以减少最终沉淀物中凋亡细胞碎片的出现。植物 EVs 的分离方法，如差速离心和梯度密度离心，可以基于大小和密度对不同类别的 EVs 进行分离，但这些方法不能充分纯化一个特定的 EVs 亚型。
跨界 RNA 干扰、跨界小 RNA 运输及选择性装载
跨界 RNA 干扰（Cross-kingdom RNAi）最早在拟南芥与病原菌灰葡萄孢的相互作用中被观察到。在拟南芥和番茄寄主植物上感染时，灰葡萄孢通过向植物细胞传递 sRNAs 来沉默植物免疫基因，这些 sRNAs 与宿主的 AGO1 蛋白结合。病原菌 sRNAs 与宿主 AGO1 蛋白结合并靶向参与植物免疫应答的基因，包括植物激酶基因，这些基因通常参与介导植物防御的信号转导途径。真菌 sRNAs 效应因子在真菌的致病性和毒力中发挥重要作用。大多数真菌 sRNAs 效应因子源自长末复序列（LTR）反转录病毒转座子，并由真菌的核糖核酸酶（DCL）产生。除了真菌病原体和植物之外，跨界 RNA 干扰也是许多不同物种中的一个保守机制，跨界 RNA 转运也发生在宿主-共生微生物相互作用中。
其次，跨界 RNA 干扰是双向的，sRNAs 从微生物传递到宿主，同时也从宿主细胞传递到相互作用的微生物中。作为植物的防御响应的一部分，由 DCL 蛋白生成的一些植物 sRNAs 被传递到相互作用的微生物/害虫中，并沉默对病原体/害虫感染至关重要的靶基因，从而减少植物疾病。除了植物与微生物/寄生物之间的相互作用，跨界 RNA 干扰或跨生物 RNA 干扰也在哺乳动物和昆虫宿主与其病原体/寄生物之间观察到。之前在小鼠神经元的研究中发现，共享一个保守的四核苷酸基序的 miRNA 被选择性地装载到 EVs 中。在哺乳动物囊泡生物学中已经确定了基于保守基序或 RNA 结合蛋白选择性 RNA 装载进 EVs 的机制，但在植物和微生物 EVs 的研究中，对选择性装载的探索才刚刚开始。
病原体来源的 EVs 及其生物学研究
在所有真核和原核细胞中，EVs 分泌是一个保守的过程。研究已经开始揭示微生物 EVs 在介导细菌和真菌与宿主相互作用中的重要作用。最近的一篇综述强调了真菌细胞壁的可塑性，使得直径为 200 纳米的囊泡可以在真菌细胞内外自由通过，尽管最初对真菌细胞壁孔径的测量结果较小。最新的蛋白质组学数据显示，真菌 EVs 富含细胞壁修饰酶，这可能有助于真菌 EVs 穿越植物细胞壁。这突显了细胞壁的动态和灵活性，并提供了关于如何使囊泡在较厚细胞壁的生物体内外移动的信息。此外，EVs 的膜具有可塑性和足够的结构适应性，可以促进穿越细胞壁的过程。
微生物 EVs 含有特定的货物，如 DNA、RNA、代谢物和蛋白质，可能参与病原体形成和调节宿主免疫。大多数微生物 EVs 是通过差速离心法在预定时间点从细胞培养物中分离得到的，以避免捕获垂死细胞。人体肠道中的细菌已被证明能释放细菌 EVs，进入血液和淋巴系统，游走到全身的远端器官。细菌 EVs 对人体细胞可以产生有益或有害的影响，如诱导树突状细胞极化或刺激癌细胞增殖。在过去的十年中，微生物 EVs 的研究主要集中在感染哺乳动物的病原体上，对来自植物病原体的 EVs 的报道有限。对植物病原菌效应蛋白的分析主要集中在具有信号肽的预测分泌蛋白上，病原体 EVs 的蛋白质组学分析可能有助于发现一类新的以前未被识别的病原体效应蛋白。
植物 EVs 的潜在应用
植物 EVs 在植物病原体相互作用中在运输基因载体方面有重要作用，促使人们努力开发这些自然 EVs 的纳米载体模拟物，用于农业中基于 RNA 干扰的病原体控制策略以及医学领域中的药物传递剂（图3）这些有机纳米载体可以由各种材料组成，包括基于脂质的人工纳米囊泡和植物来源的纳米囊泡。
来自各种水果和蔬菜的纳米囊泡因其许多有利特性而引起了人们的广泛关注，用于纳米医学和药物传递（图3）。由于纳米囊泡来自植物，它们具有生物相容性、可生物降解性和易于规模化生产的特点。此外，纳米囊泡的小尺寸增强了它们在人体内的细胞摄取能力。纳米囊泡还可以耐受胃肠道，并穿越生物屏障，如血脑屏障，以传递生物分子。
图3 植物 EVs 的潜在应用
根据植物来源的不同，纳米囊泡可能还具有独特的固有特性。例如，柠檬汁来源的纳米囊泡表现出抗癌活性，而姜 EVs 具有抗炎活性，并且被微生物优先摄取。此外，西瓜来源的细胞外囊泡可以影响肠细胞分泌，从而影响胎盘蛋白质组。因此，纳米囊泡不仅作为纳米载体，而且作为可调节微生物和哺乳动物细胞活性的治疗剂本身而受到越来越多的关注。对来自不同果汁源的这些纳米囊泡的载荷和成分进行详细研究，以更好地了解它们的生物功能。对纳米囊泡进行修改可以使它们更适合用于治疗。例如，可以从纳米囊泡中提取脂质，并重新组装成纳米颗粒或经化学处理来修改其结构和性质。这些修改已被证明使纳米囊泡更容易携带 RNA 或特定药物。还需要进一步研究，以全面了解纳米囊泡的深度和广度。最后，纳米囊泡可以通过在病原体控制策略中传递生物载荷来在农业上具有重要应用。特别是，与当前的合成纳米载体相比，纳米囊泡的环境友好性和可扩展性使其非常具有吸引力。
结论
植物和微生物 EVs 的研究近年来呈现出迅速兴起和扩展的趋势，揭示了 EVs 在生物间细胞间通讯中的重要作用，使得囊泡生物学领域迈出了超越细胞内通讯范畴的新步伐。但在植物和微生物 EVs 的组成物、生成机制以及 RNA、蛋白质和代谢物传递方面存在着明显的知识空白。正如我们所强调的，跨界 RNA 干扰是双向的，植物与其互作生物之间的 sRNAs 传递会诱导转录基因沉默。植物与真菌互作、植物与其他微生物和害虫（包括细菌、卵菌和寄生虫）之间存在跨界 RNA干扰。对植物 EVs 和跨界 RNA干扰的进一步了解将促进新一代 RNA “杀菌剂”的开发和应用，以控制由真核病原体引起的植物疾病。此外，植物来源的 EVs 和纳米囊泡在新型医学疗法中具有潜在作用。将来，可以通过工程化植物来源的 EVs 来携带特定的载荷，如治疗性 RNA 或药物，同时提供保护性的包裹，并有效地将治疗剂传递到人类细胞中。
引用本文
Cai Q, Halilovic L, Shi T, Chen A, He B, Wu H, Jin H. Extracellular vesicles: cross-organismal RNA trafficking in plants, microbes, and mammalian cells. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids 2023;4:262-82. http://dx.doi.org/10.20517/evcna.2023.10
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作者简介
蔡强 (Qiang Cai)，武汉大学生命科学学院教授，博士生导师。蔡强教授曾于上海交通大学及加州大学河滨分校学习和深造，2019 年加入武汉大学生命科学学院进行发育生物学的研究与教学，主要研究方向为小分子 RNA 调控植物与病原物的互作机制、细胞通讯在植物与病原生物互作中的调控过程等。蔡教授负责主持着多项重大科研项目，其中包括国家自然科学基金面上项目、杂交水稻全国重点实验室培育项目以及湖北省自然科学基金杰青项目等。研究成果发表在 Science、Nature Plants、Nature Communications 等国际知名期刊上。
金海翎 (Hailing Jin)，美国加州大学河滨分校教授兼 Cy Mouradick 讲座教授，美国微生物学会院士(AAM)，美国科学促进会（AAAS）会士，美国国家发明家科学院高级成员，植物分子遗传学家。金海翎教授主要研究方向是植物免疫和病原体毒力的分子机制。其中主要研究项目包括跨界 RNAi 和细胞外囊泡介导的植物和病原体之间的小 RNA 运输、植物与病原菌互作中小分子 RNA 的作用机理及生物学功能、植物免疫反应的表观遗传调控等。其研究成果在 Science、Nature Plants、PNAS、Nature Communications 等国际知名期刊上发表论文 110 余篇，H-index 54 (Scopus)，i10-index 89，是该领域内最为权威和影响力的科学家之一。
转自：“iPlants”微信公众号
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