中国农科院夏兰琴团队成功研发高效双碱基编辑器并在水稻中实现EPSPS基因编码区的定向进化

以下文章来源于JIPB ，作者JIPB

近年来，由CRISPR/Cas系统衍生的植物基因组单碱基编辑技术，具有操作简便、编辑效率高等优势，在农作物基因功能研究和精准育种等方面展现出了广阔的发展潜力和应用前景。虽然nCas9(D10A)介导的单碱基编辑技术在植物体内已实现较高的编辑效率，但由于其NGG PAM（原间隔区序列）的限制，经常无法获得含有期望编辑位点的突变体。同时，具有更广PAM 兼容性的nCas9(D10A)-NG介导的单碱基编辑技术尤其是双碱基融合编辑系统在植物中的编辑效率依然非常低，因此，迫切需要建立更高效、编辑范围更广的植物双碱基融合编辑技术体系。

JIPB近日在线发表了中国农业科学院作物科学研究所作物精准育种技术创新团队题为“Artificial evolution of OsEPSPS through an improved dual cytosine and adenine base editor generated a novel allele conferring rice glyphosate tolerance”的研究论文（https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/jipb.13543）。该研究成功开发了一种nCas9(D10A)-NG介导的高效胞嘧啶和腺嘌呤双碱基编辑融合系统STCBE-2，可以通过使用一个靶向sgRNA实现C-to-T和A-to-G的碱基转换。利用STCBE-2对水稻OsEPSPS基因编码区保守结构域和预测的草甘膦结合区域进行近饱和突变，获得了高抗草甘膦的水稻新型基因资源。

本研究通过将不同来源的胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶与nCas9(D10A)-NG融合，构建了4个潮霉素代理的胞嘧啶和腺嘌呤双碱基融合编辑系统STCBEs （Surrogate two-component composite base editing systems），利用6个重要农艺性状基因的内源靶标在水稻原生质体中对4个STCBEs的碱基编辑活性进行了测试，结果表明，由与nCas9(D10A)-NG的N-末端融合的胞嘧啶脱氨酶evoFERNY和腺嘌呤脱氨酶TadA8e以及与nCas9(D10A)-NG的C-末端连接两个拷贝的尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白UGI组成的STCBE-2具有更高的编辑效率，C-to-T和A-to-G碱基编辑效率分别高达25.5%和25.3%。STCBE-2同时表现出较宽的编辑窗口，C-to-T编辑窗口为PAM序列的C1至C14（将PAM远端计算为位置1）和A-to-G编辑窗口为PAM序列的A1至A10。同时，该研究利用4个水稻内源基因的16个靶标来评估STCBE-2的编辑效率，这些基因被报道用于测试水稻原生质体中STEME-NG的活性。结果表明，STCBE-2可以使C-to-T和A-to-G碱基编辑效率分别提高至23.1%和24.2%。与STEME-NG相比，STCBE-2将C-to-T和A-to-G碱基编辑效率分别提高了2.9倍和13.2倍，表明STCBE-2可同时进行C-to-T和A-to-G的高效碱基转换。

进一步，本研究利用上述双碱基融合编辑系统STCBE-2，针对水稻内源OsEPSPS基因编码区的保守结构域和预测的草甘膦结合区域设计了35个sgRNA进行定向进化。经过潮霉素和草甘膦的筛选，研究人员在预测的草甘膦结合区域发现了一个新的OsEPSPS等位基因，该等位基因具有Asp-213-Asn的突变，该突变赋予了水稻抗田间推荐用量四倍的草甘膦耐受性。这表明，高效双碱基融合编辑系统的建立，为水稻以及其他作物重要农艺性状基因的定向进化提供了有效工具，有望大大促进农作物定向遗传改良的进程。

图1. 高效胞嘧啶和腺嘌呤双碱基融合编辑系统的开发和定向进化OsEPSPS产生耐草甘膦水稻

中国农业科学院作物科学研究所张臣博士为论文第一作者，夏兰琴研究员为通讯作者。大北农金色农华种业公司林勇和张阳军也参与了此项工作。该研究得到国家自然科学基金基础科学中心项目、海南崖州湾种子实验室揭榜挂帅重大项目、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项、中国农业农村部基因编辑创新利用重点实验室（海南）和国家作物分子育种工程研究中心资助。

转自：“iPlants”微信公众号

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