导读
目前对青蒿素（ART）抗疟机制的研究主要集中在自由基烷基化的共价药物结合靶点上，而非共价结合靶点的报道较少。在这里，我们开发了一种新的ART光亲和探针，通过化学蛋白质组学在全局范围内捕获和鉴定ART的抗疟靶蛋白。结果表明，ART可以通过共价和非共价修饰与寄生虫蛋白结合，这可能协同促进抗疟作用。本研究丰富了ART抗疟靶点的研究现状，为进一步探索ART的抗疟机制提供了新的视角。
在这里，我们开发了一种新的青蒿素光亲和探针，通过化学蛋白质组学在全局范围内捕获和鉴定青蒿素的抗疟靶蛋白
论文ID
原名：Chemical proteomic profiling with photoaffinity labeling strategy identifies antimalarial targets of artemisinin
译名：利用光亲和标记策略的化学蛋白质组学分析确定了青蒿素的抗疟疾靶点
期刊：Chinese Chemical Letters
IF：9.1
发表时间：2023.4
通讯作者：王继刚和徐承超
通讯作者单位：中国中医科学院中药研究所
实验设计
实验结果
疟疾仍然对全球人类健康具有严重威胁，2021年疟疾病例达2.47亿例，死亡人数约61.9万。青蒿素（ART）作为推荐的疟疾一线治疗药物，在应对疟疾肆虐和多药耐药性传播方面具有决定性地位。在过去的几十年里，抗逆转录病毒疗法的作用机制得到了广泛的研究，特别是在抗疟疾耐药性出现的背景下。在我们之前的研究中，我们使用基于活性的蛋白质图谱（ABPP）策略首次证明了ART显著的抗疟作用是亚铁血红素激活其过氧化桥的结果。一旦被激活，各种寄生虫蛋白质和脂质就会被ART的自由基烷基化，与药物形成共价键，导致寄生虫迅速死亡。此外，作为ART活化剂的亚铁血红素也是ART烷基化的靶点，这导致不能形成疟原虫色素（Hz）和寄生虫毒性。使用类似于ABPP的方法，许多研究使用可点击的ART衍生探针（该探针具有炔烃或叠氮化物基团）确定了许多ART的共价蛋白靶点。
尽管血红素介导的共价蛋白修饰已被解释为ART抗疟疾活性的关键机制，但ART也可能以非共价方式在寄生虫中与蛋白质和DNA结合。此外，对ART的其他药理活性（包括抗糖尿病和抗癌活性）的机制研究也报道了ART的某些功能独立于自由基烷基化的共价结合反应。然而，关于ART的非共价蛋白靶点及其在ART抗疟疾中的贡献及意义仍尚未被完全阐述清楚。因此，对疟疾寄生虫中ART的非共价靶点进行化学蛋白质组学分析将为ART的抗疟疾机制提供更全面和深入的见解。
为了全面丰富和鉴定ART的靶蛋白，包括共价和非共价结合蛋白，我们在本工作中引入了一种基于ABPP的光亲和标记策略。首先，我们根据图1A中的合成方案设计并合成了一种基于活性的ART光亲和探针（APP），其中在不改变内过氧化物桥药效团的情况下，将二氮嗪光活性基团和炔烃报告官能团结合在羰基位置。APP中的二氮杂啉基团可以在紫外线（UV）照射下通过产生碳自由基与相邻蛋白质的亲核残基反应（λ = 365nm），这使得能够无偏地鉴定非共价ART靶点。我们测量并比较了APP和青蒿琥酯（ATS）抗恶性疟原虫3D7菌株的半数最大抑制浓度（IC50），ATS是一种常用的ART衍生物，具有高的水溶性和与ART相似的杀寄生虫能力。ATS和APP对3D7的IC50值分别为5.96和0.64 nmol/L（图1B）。我们在恶性疟原虫7G8菌株中也可以观察到APP优于ATS的卓越抗疟活性（附录图S1）。
图1 （A）青蒿素光亲和活性探针（APP）的合成方案。（B）APP和青蒿琥酯（ATS）对恶性疟原虫3D7株抗疟活性的测定。（C）APP介导的用于标记和鉴定青蒿素（ART）靶蛋白的ABPP的一般工作流程。（D）在有或没有紫外线照射的情况下，以剂量依赖的方式在寄生虫裂解物中体外标记APP 4小时。（E）过量的ATS可以在紫外线照射下和不照射下特异性竞争APP的靶蛋白。（F）共聚焦成像显示，APP（600nmol/L）与受感染的红细胞（iRBC）孵育1h后可迅速分布到寄生虫中，并在紫外线照射下通过预孵育过量的ATS（3μmol/L）消除（比例尺 = 2µm）。HZ，疟原虫色素；TAMRA，羧基四甲基罗丹明；CBB，考马斯亮蓝。
接下来，我们使用APP根据图1C所示的工作流程，在有或没有UV照射的情况下进行荧光标记实验。如图1D所示，无论是否存在紫外线照射，APP标记的寄生虫蛋白的荧光强度都以剂量依赖的方式增加。此外，在相同浓度下，紫外线照射组的荧光强度略强于非紫外线照射组。这表明，除了通过自由基反应与蛋白质进行不可逆共价结合之外，ART确实也可以以非共价方式可逆地结合一些蛋白质，或者以两种方式结合同一靶蛋白。此外，在这两种条件下，ATS可以竞争性地抑制APP标记的荧光信号（图1E），表明APP的大多数非共价和共价靶标应该与ATS的靶点相同。为了进一步证实ART与寄生虫蛋白质的结合，我们在紫外线照射下通过APP标记对活细胞进行了体内成像。我们观察到APP产生的红色荧光在30分钟内迅速分布并积聚在感染的红细胞（RBC）中，但在正常的RBC中则没有这一现象。添加过量的ATS可以消除APP标记中的红色荧光，这与凝胶中的荧光标记一致（图1F）。总之，我们在这里表明，APP是一种新的、令人满意的光亲和探针，具有与ATS相似的活性，可以通过化学蛋白质组学进一步用于分析ART的非共价和共价靶点。
由于荧光标记结果表明ATS可以可逆和不可逆地与寄生虫蛋白结合，接下来，我们通过化学蛋白质组学方法鉴定和区分了紫外线照射和非紫外线照射处理组中APP的蛋白质靶点。带有炔基团的APP所标记的蛋白质靶点首先通过铜催化的叠氮化物-炔环加成（CuAAC）与生物素-叠氮化物标签连接，然后通过链霉亲和素磁珠pull-down。我们然后采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）结合串联质谱标签（TMT）标记对富集的蛋白质进行鉴定和定量（图1C）。从紫外线照射组和非紫外线照射组分别鉴定出77个和41个蛋白质靶点（图2A和B），其中32个蛋白质重叠，共有86个独特的蛋白质（图2C）。重叠的靶点表明可以通过共价和非共价结合模式与ART相互作用的蛋白质。更重要的是，仅在紫外线照射组中鉴定出45种蛋白质，表明这些蛋白质可能以主要非共价的方式与ART结合。上述结果表明，在寄生虫体内积累过程中，蛋白质与活化的ART之间存在共价结合，但同时也存在非共价结合相互作用。然而，这些靶点与ART的非共价相互作用可能被以前没有使用光亲和探针的研究所忽略。
图2 （A，B）基于ABPP实验在紫外照射或不照射下通过APP鉴定的77（A）和41（B）个靶蛋白的散点图。两张图都显示了APP（600 nmol/L）和DMSO组（x轴）与APP和竞争组（600毫摩尔/升APP + 3μmol/L ATS）（y轴）之间相对丰度的平均log2比。使用倍数变化（FC）>1.2和Padj<0.05作为命中点选择标准。已鉴定的靶蛋白的完整列表如支持信息中的表S1和S2所示。（C）APP在两种不同条件下鉴定的靶蛋白的维恩图。（D）所有86种已鉴定靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。（E）通过基于APP的ABPP对86种已鉴定靶蛋白的富集生物过程（BP）进行基因本体论（GO）分析。
证实非共价相互作用的存在验证了我们的推测，即与先前的研究相比，对ART靶点（包括新的非共价靶点）的全面鉴定可能会对ART的抗疟机制提供更全面的见解。然后，我们对86个独特的蛋白质靶点进行了生物信息学分析。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析显示，相互作用网络集中在鸟苷三磷酸（GTP）水解、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）脱乙酰化组蛋白和蛋白质折叠上（图2D）。此外，基因本体论（GO）分析表明，葡萄糖产生和代谢的途径高度富集（图2E）。因此，葡萄糖代谢相关途径可能是ART杀死寄生虫的关键途径。
在恶性疟原虫的红细胞阶段，寄生虫的生存在很大程度上依赖厌氧糖酵解提供的能量进行快速代谢。寄生虫的葡萄糖消耗水平比宿主细胞高30-50倍，这是因为相关代谢酶的活性和表达更高，这些代谢酶可能是抗疟药物的天然靶点。在我们的靶点数据库中发现了葡萄糖糖酵解途径中的三种酶，L-乳酸脱氢酶（PfLDH，PF3D7_1324900）、磷酸丙糖异构酶（PfTIM，PF3D7_1439900）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（PvGAPDH，PF3D9_1462800）。LDH通过催化丙酮酸转化为乳酸参与糖酵解的最后一步。TIM是一种二聚糖酵解酶，催化D-3-磷酸甘油醛异构化为二羟丙酮磷酸，在糖异生中发挥重要作用。先前的一项研究表明，在疟疾感染期间，由于对TIM的抗体反应，患者可能会患上严重的溶血性贫血。GAPDH将3-磷酸甘油醛还原为1,3-二磷酸甘油酸，抑制GAPDH可以阻止ATP的产生并加速ATP的消耗。此外，GAPDH已被视为疟疾诊断的潜在生物标志物。
接下来，我们成功表达并纯化了三种糖酵解相关酶的重组蛋白，以验证它们与ART的相互作用。首先，通过荧光标记评估它们在不同条件下与APP的结合行为（图3A）。在紫外线照射下，APP对TIM的标记强度显著高于添加氯化血红素和抗坏血酸钠（NaVc）的点击化学条件下，表明TIM是主要依赖非共价结合相互作用的ART靶点。相反，基于在相同条件下标记强度的相反结果，LDH可能是ART的共价靶点。至于GAPDH，在两种条件下相似的标记效果表明它既是ART的共价靶点，也是ART的非共价靶点。此外，APP对三种酶的标记强度都是剂量依赖性的（图3B）和时间依赖性（图3C），并且可以通过ATS的预孵育来消除（图3D）。我们在原位pull-down蛋白质印迹实验中也观察到类似的竞争效应（图3F）。有趣的是，在与半胱氨酸（Cys）残基阻断剂碘乙酰胺（IAA）预孵育后，APP的荧光标记强度不同程度地减弱（图3D），而IAA炔基探针（IAA-P）对蛋白质的荧光标记在用ATS预处理蛋白质后几乎完全消除（图3E），提示Cys可能是ATS与靶点结合的位点之一。
图3 （A）用APP荧光标记重组PfTIM、PfGAPDH、PfLDH蛋白。（B）亚铁血红素（氯化血红素+NaVc）激活的APP（1μmol/L）在紫外线照射下以剂量依赖和（C）时间依赖的方式特异性结合重组蛋白。（D）用过量的ATS（10μmol/L）和IAA（10μmol/L）预孵育可以与APP结合重组蛋白竞争。（E）ATS可以竞争IAA-P与重组蛋白的结合。（F）通过pull-down蛋白质印迹原位验证APP与3种靶蛋白的原位特异性结合。Flu，荧光。
此外，我们通过免疫荧光实验证实了APP与其蛋白质靶点以及线粒体（葡萄糖代谢的主要位点）的高度共定位（图4A和B）。更重要的是，酶活性实验表明，ATS可以以剂量依赖的方式有效抑制已鉴定靶点的催化活性（图4D–F）。基于这些证据，我们得出结论，ART可以通过共价或非共价结合模式直接结合与葡萄糖代谢相关的关键酶，并进一步抑制其活性，最终通过阻碍能量代谢过程导致寄生虫死亡。随后，为了鉴定ART与关键蛋白质结合的可能共价结合位点，我们使用串联质谱法在ATS孵育后精确定位PfLDH中的结合残基，鉴定缬氨酸53（Val 53）为结合位点，并通过对接模拟进一步验证（图4C和G）。
图4 （A）紫外线照射下通过免疫荧光实验对APP与靶蛋白和线粒体的免疫荧光共定位。比例尺：1μm。（B）用Pearson系数和Overlap系数对共定位进行定量分析。（C）重组PfLDH蛋白上ATS结合位点的鉴定。（D–F）ATS抑制重组靶蛋白PfTIM、PfGAPDH和PfLDH的酶活性。（G）ATS与PfLDH（PDB:1T24）结合的对接模拟，结合能为-5.6（kcal/mol）。
结论
总之，我们通过开发ART的光亲和探针，探索了寄生虫中ART的靶蛋白和结合模式，并在一组蛋白质中验证了这些结果。结果表明，ART可以通过共价和非共价修饰与寄生虫蛋白结合，这可能共同促进抗疟作用。然而，这两种结合模式在抗疟过程中的关系仍有待进一步探索。我们的工作丰富了ART抗疟靶点的研究，为进一步探索ART的抗疟机制提供了新的视角。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1001841723001596
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
