导读
天然产物具有多种药理活性，是发现新药的重要来源。丹参已被证明在心脏病治疗中具有很好的疗效，使其成为心血管药物发现的候选药物。目前，全蛋白质组对丹参衍生的天然产物的磷酸化水平的定量分析尚不充分，这可能会对其作用机制的研究产生偏见。本研究旨在评估丹参衍生的生物活性化合物诱导的全局信号干扰及其与心肌缺血//再灌注损伤治疗的潜在关系。我们采用定量蛋白质组和磷酸蛋白质组分析来鉴定小鼠缺血再灌注（IR）损伤心脏中失调的信号传导。我们基于IR相关的磷酸化事件，使用绘制蛋白质和磷酸化位点相对丰度的综合方法，比较了丹参衍生化合物诱导的变化。采用同位素化学串联质谱标签（TMT）标记的多路复用策略生成无偏的定量蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据。我们使用Orbitrap Fusion Tririd质谱仪和同步母离子选择MS3检测模式进行了高度准确和精确的TMT定量；使用MaxQuant（2.0.1.0）分析质谱原始文件，并使用Perseus（1.6.15）进行统计和生物信息学分析。我们量化了IR小鼠模型受损心脏组织中的3661种蛋白质和11000多个磷酸化位点，扩展了我们对IR损伤中信号通路和其他生物过程的了解。接下来，通过分别量化五种丹参生物活性化合物处理的H9c2细胞的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，我们鉴定了1548种和5545种不同表达的蛋白质和磷酸化位点。结果显示，五种丹参衍生的生物活性化合物调节心肌细胞磷酸化修饰的能力存在巨大差异，二氢丹参酮（DHT）通过调节AMPK/mTOR信号通路保护IR损伤。这项研究为在全蛋白质组内分析药物/天然产物调节的磷酸化修饰水平提供了一种新的策略，从而更好地了解细胞信号通路和下游表型反应。
研究亮点：
1. 心肌缺血/再灌注损伤的超深层（磷酸化）蛋白质组分析；
2. 天然产物筛选抗缺血/再灌注损伤的蛋白质组学策略；
3. 二氢丹参酮I激活心肌细胞AMPK并抑制mTOR通路。
论文ID
原名：Integrated proteomics and phosphoproteomics profiling reveals the cardioprotective mechanism of bioactive compounds derived from Salvia miltiorrhiza Burge
译名：综合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析揭示了丹参生物活性化合物的心脏保护机制
期刊：Phytomedicine
IF：7.9
发表时间：2023.04
通讯作者单位：中国药科大学
实验设计
实验结果
1. 用定量蛋白质组学和磷酸蛋白质组学方法表征心肌缺血/再灌注损伤的疾病特征
为了全面了解心肌IR损伤过程中发生的病理变化，我们对接受假手术（sham）、缺血（IS）和IR手术的小鼠梗死心脏进行了定量蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析（图1A）。我们使用同位素化学标签（TMT）标记的多路复用策略来生成无偏的定量蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据。我们总共量化了心脏组织中3664种心脏蛋白和11000多个磷酸化事件（图1A，图S1A-S1B）。
图1 缺血/再灌注损伤后小鼠心脏的蛋白质组和磷酸蛋白质组分析
（A）蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析的全局工作流程。（B，E）蛋白质组（B）和磷酸化蛋白质组（E）数据的主成分分析（PCA）。（C，F）火山图显示了基于双侧学生t检验的IR组和Sham组之间差异表达蛋白质（C）和磷酸化位点（F）（FDR<0.05，S0 = 0.1）。（D）热图显示，在三组中，显著调节的蛋白质（倍数变化>1.5）。
1.1 心肌缺血/再灌注损伤的蛋白质组分析
蛋白质组学的主成分分析（PCA）显示，Sham、IS和IR组在蛋白质组水平上没有明确分离（图1B）。基于Perseus（v1.6.15）进行的双侧学生t检验（图1C，补充数据S1），我们在IR组和Sham组之间鉴定了35种差异表达的蛋白质。
我们发现，与Sham心脏相比，IR心脏中几种蛋白质的浓度增加。S100a9/S100a8被列为上调程度最高的蛋白（图1D），并且在先前的转录组分析中被视为IR损伤期间心肌细胞死亡的关键诱导分子。我们还观察到炎症和免疫相关蛋白的显著增加，如中性粒细胞颗粒蛋白（Ngp）和几丁质酶3样蛋白3（Chil3）。肌球蛋白7（Myh7）是一种为心脏收缩提供动力的分子马达，在IS和IR心脏中表现出两倍的下降。
1.2 心肌缺血/再灌注损伤的磷酸蛋白质组分析
我们进行了磷酸蛋白质组学分析，以探索IR损伤中的异常信号通路。对完全定量磷酸化值的PCA分析显示，IS、IR和Sham组之间存在明显的分离（图1E）。我们在Sham和IR心脏之间观察到342个磷酸位点具有统计学显著变化（图1F，2A，补充数据S2）。
图2 缺血/再灌注损伤中涉及的关键磷酸化事件和生物学过程
（A）热图描绘了IR和Sham组中显著调节的磷酸化事件的表达，在IS组中具有相应的表达水平。（B）IR组和Sham组之间磷酸化事件显著变化的基因本体论（GO）富集分析（P<0.05）。（C）在IR组中，激酶底物模体在显著调节的磷酸位点中富集（Benjamini Hochberg FDR<0.05）。（D）热图显示Sham、IS和IR心脏中排序前几的磷酸化位点的磷酸化水平。使用TBtools（v1.0098696）对强度进行log2转换和处理。
GO富集分析（图2B）显示，上调的磷酸位点在心肌结构、钙离子稳态、肌浆网等方面富集，而下调的磷酸化位点富含蛋白激酶活性。激酶底物富集分析（图2C，补充数据S3）表明，磷酸化位点集中在心脏收缩性、能量代谢和信号级联的激酶上，如PKC、PKA、CaMKII和AMPK。
在IR损伤的进展过程中，参与钙稳态和心脏收缩性的几种调节蛋白的磷酸化模式发生了显著变化（图1F，2D）。特别是，与Sham心脏相比，在钙循环中起关键作用的磷蛋白聚糖（Pln）的双位点磷酸化（S16/T17）在IR心脏中增加了两倍。此外，我们还观察到肌钙蛋白I（Tnni3）在S23/S24的过度磷酸化，这是一种对细丝蛋白的翻译后修饰。相反，IR心脏中Speg（S2413）和Jph2（S231/S234）的磷酸化水平降低。最近的研究将Speg定义为一种关键的心脏Ca2+调节因子，可维持T小管的形成和连接膜复合蛋白的磷酸化。
此外，参与细胞能量代谢的几种激酶在磷酸化水平上表现出显著变化。Pdha1是一种位于线粒体中的丙酮酸脱氢酶，其三个磷酸化位点（S232、S293和S300）在IS心脏中严重缺失，但在IR处理后显示出适度恢复（图2D）。最近的研究报道，AMPK介导的Pdha1活性增强和随后的葡萄糖氧化可以减少心肌梗死面积，我们发现AMPK在IR心脏中相应富集（图2C）。AMPK被确定为心肌缺血期间的代谢调节剂，在细胞内适应能量应激中发挥关键作用。
2. 蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析揭示了五种丹参衍生化合物的分子机制差异
丹参及其生物活性衍生物为心脏病治疗药物的发现提供了丰富的资源。在本研究中，我们研究了五种丹参衍生化合物对心肌细胞（H9c2）细胞系的分子机制（图3A）。我们使用所提出的TMT标记多重工作流程鉴定并量化了6561个蛋白质和24420个磷酸化位点（图S2）。多重方差分析检验（FDR<0.05）显示，蛋白质组和磷酸蛋白质组水平分别发生了1548和5545次显著变化（补充数据S4、S5，图S3A、3B）。与其他化合物相比，用浓度为2µM和10µM的二氢丹参酮I（DHT）以及10µM浓度的丹参酮Ⅰ（TSI）处理，调节的磷酸位点和蛋白质几乎是其他化合物的三倍。DHT处理组在蛋白质和磷酸化水平上倾向于与其他组分离（图3B，S3A-S3C）。
为了进一步深入了解丹参化合物对IR损伤的潜在作用，我们专注于化合物基质与IR和IS基质之间重叠的差异表达磷蛋白（图3C）。三个数据集总共有86个磷蛋白交叉，具有代表性的位点如图所示（图3D）。例如，我们在Bad上观察到S156和S171的过度磷酸化，据报道其适应生存刺激并阻断Bad的促凋亡活性。磷酸化Pdlim5（S119）和Stim1（S543）也发生了显著变化，这两种物质都是心脏发育和细胞钙稳态的重要调节因子。
图3 丹参衍生生物活性化合物的调控概况
（A）蛋白质组学和磷酸蛋白质组学工作流程。H9c2细胞用2µM或10µM化合物处理。（B）显著调节的磷酸位点（>1.5倍变化）和五种化合物之间差异调节磷酸位点的分层聚类分析。（C）丹参化合物和小鼠模型数据集之间调节的磷蛋白的维恩图。（D）图3C中三个数据集中共存的代表性磷位点的热图。（E）不同化合物浓度诱导富含PKC、PKA和CaMKII的磷酸位点发生的倍数变化。（F）蛋白质印迹证实了化合物和DMSO之间的磷酸化化学计量关系。
基于激酶底物富集分析，我们发现不同变化的磷酸位点集中在35种激酶上（补充数据S6）。11种激酶与IR数据集中富集的激酶重叠（图S3D），PKC、PKA和CaMKII按FDR值排名前三。在DHT（2µM，10µM）和TSI（10µM）处理中，这三个底物的磷酸化水平显示出更显著的变化（图3E）。蛋白质印迹证实了磷酸化蛋白质组学分析中出现的磷酸化化学计量关系（图3F）。此外，Prkaa1的磷酸化S496显著增加（图3E），这是AMPK亚单位α-1，是细胞能量代谢和线粒体稳态中的关键能量传感器蛋白激酶。
因此，这些发现表明DHT对心肌细胞的细胞能量代谢、细胞钙离子稳态和心脏发育具有显著的调节作用。为了进一步探索这些机制，我们研究了DHT处理的全局蛋白质组和磷酸蛋白质组水平。
3. DHT作用和功能机制的全局表征
为了测定用DHT剂量梯度处理12小时的H9c2细胞的整体蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱，我们使用了TMT11策略（图S4、S5）。我们的分析确定了624种蛋白质和7800个磷酸化位点，它们在梯度剂量下显示出显著的变化（补充数据S7-S8）。值得注意的是，我们发现，与0.1至1µM的较低剂量相比，2µM的DHT刺激了蛋白质组和磷酸蛋白质组水平的更显著变化（图S6A-S6B）。分层聚类和主成分分析图在蛋白质组和磷酸蛋白质组水平上显示了相似的模式（图S6C-S6D）。
我们进行了KEGG和GO富集分析，以研究DHT（2µM）处理对生物功能的影响。通路富集分析显示，DHT显著影响各种信号通路，包括细胞周期、胰岛素、mTOR、PI3K-Akt和AMPK（图4A）。生物过程（GO-BP）富集分析表明，与细胞代谢和细胞对刺激的反应相关的过程显著富集（图4B）。此外，富集的细胞成分（GO-CC）与线粒体、内质网和收缩纤维部分有关（图4C）。这些成分是心脏保护信号的关键效应物。
图4 DHT剂量之间的生物功能差异
（A-C）显示了不同剂量DHT处理（0.1µM、0.25µM、0.5µM、1µM和2µM）的蛋白质和磷蛋白中显著富集的KEGG途径、GO生物过程和GO细胞成分（Benjamini–Hochberg FDR<0.05）。（D-F）图4C中线粒体、肌浆网部分和收缩纤维部分的蛋白质和磷酸化位点的表达谱。上调和下调的蛋白质和磷酸化位点分别以橙色和绿色突出显示。
3.1 线粒体
DHT处理显著调节了与线粒体相关的蛋白质组和磷酸化蛋白质组（图4D）。例如，2µM DHT上调Gsk-3βS9的磷酸化，据报道，这可以减弱线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放，并缓解IR损伤。我们之前的工作表明，DHT诱导的PKB/GSK-3β/Fyn信号传导导致NRF2的核积累，并通过维持氧化还原稳态来保护心脏免受IR的影响。此外，我们在S364和S365观察到Cx43对2µM DHT处理的低磷酸化响应。线粒体Cx43的激活在K+内流和ROS释放中起着关键作用，并已被确定为新出现的抗IR治疗靶点。
3.2 肌浆网
DHT对肌浆网（SR）也表现出强烈的调节作用（图4E）。在蛋白质组水平上，位于SR中的几种脂质生物合成酶显示出四倍的减少，如Fasd1、Fasd2和Scd1，它们是类固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）的靶点。先前的研究发现，Fads2可能通过调节线粒体反应来加重IR损伤。此外，在2µM DHT处理后，Nhe1在S707（Na+-H+交换器1）的磷酸化减少了两倍，这可能赋予Nhe1对IR损伤的心脏保护抑制作用。
3.3 收缩纤维
DHT强烈影响与收缩纤维成分相关的蛋白质和磷酸化事件（图4F）。我们的研究揭示了2µM DHT处理诱导的两种小的热休克蛋白，即Cryab（Hspb5）和Hspb1磷酸化的显著变化。据报道，p38 MAPK在S59处对Cryab的磷酸化，可通过转移到线粒体和调节MPTP开放来增强对IR损伤的保护。另一个值得注意的发现是2µM DHT诱导的Jph2磷酸化位点的上调，这在IR数据集中显示了低磷酸化（图2D）。Speg敲低小鼠Jph2磷酸化的降低与T小管和JMCs的缺失有关。
4. DHT激活心肌细胞AMPK并抑制mTOR信号通路
为了研究DHT调节的信号通路，我们分析了用2µM DHT处理后激酶底物模体的变化（图5A）。我们鉴定了AMPK和HMG-CoA还原酶（Hmgcr）激酶底物模体的显著富集，以及细胞周期相关的激酶底物模体，如Cdk、Cdc2和Chk1。AMPK是磷酸化Hmgcr的主要激酶，Hmgcr是胆固醇合成的关键酶。值得注意的是，我们观察到Atm的显著增加，已知其通过Atm/LKB1轴激活AMPK。这些发现表明DHT可能激活AMPK通路。
图5 （A）2µM DHT处理后基于线性模体的一维注释富集分析（Benjamini Hochberg FDR<0.02）。（B，D）2µM DHT诱导的AMPK（B）和mTOR（D）底物在蛋白质和磷酸化水平的调节。（C）2µM DHT对AMPK激活和mTOR通路抑制的蛋白质印迹验证。（E）基于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的DHT对AMPK/mTOR轴影响的示意图。
我们进行了进一步的分析，以研究AMPK直接磷酸化的位点，并观察到这些位点中的大多数在DHT处理后都是高磷酸化的（图5B）。具体而言，我们发现Prkab1和Prkab2是AMPK的调节β亚基和直接底物，需要S107和S108的磷酸化才能激活AMPKα-催化亚基。尽管我们没有检测到活化残基的磷酸化（T172），但观察到的Prkab1/2和Acaca（一种众所周知的AMPK底物）的过度磷酸化表明DHT处理诱导了AMPK的活化（图5B）。为了证实我们的发现，我们进行了免疫印迹，结果显示，在DHT处理后，AMPKα（T172）和Acaca（S79）的磷酸化显著增加（2µM，图5C）。与阳性对照相比，DHT诱导的AMPKα（T172）激活也得到了证实（图S7）。
我们发现DHT强烈抑制mTOR通路。这从mTORC1靶向磷酸化位点的显著减少中可以明显看出（图5D），表明DHT对mTOR的直接抑制作用。免疫印迹分析进一步证实了p70S6k及其下游底物Rps6和Eif4b的磷酸化降低（图5C）。此外，AMPK可以在S722和S792直接磷酸化作为mTORC1结合伴侣的Rptor，导致mTOR复合物失活。S722上Rptor磷酸化增加（图5B）表明，DHT诱导的AMPK激活可能有助于抑制mTOR途径（图5E）。
讨论
天然产物具有多种药理活性，已成为发现新药的宝贵资源。然而，对其靶蛋白和作用机制（MOA）缺乏了解阻碍了药物的发现过程，并且同一草药中存在具有相似化学结构的类似天然产物可能会使问题进一步复杂化。细胞中的大多数调节活性取决于翻译后修饰，仅仅在蛋白质水平上进行分析可能不足以进行深入的MOA研究。
为了解决这些问题，我们开发了一种MS3定量磷酸化蛋白质组学方法，以比较细胞中天然产物诱导的数千种磷酸化修饰的调节。我们的研究重点是研究化学结构相似但作用机制不同的类似天然产物，如丹参素、丹参酮I、丹参酮II A、二氢丹参酮和隐丹参酮，对磷酸化修饰的调节差异，所有这些都报道了心血管保护作用。我们的研究结果表明，这些化合物在调节心肌细胞磷酸化修饰方面具有不同的能力，DHT是通过调节AMPK信号通路来保护缺血/再灌注损伤的候选分子。
图6 DHT心脏保护作用的潜在机制方案
DHT可以通过调节心肌细胞能量稳态来提供对心肌缺血/再灌注（IR）损伤的保护，如图5E和图6所示。DHT处理后我们观察到硫氧还蛋白相互作用蛋白（Txnip）表达减少了四倍（图4D），S621的Tbc1d1磷酸化增加了两倍（图5B）。先前的研究报道，Txnip和Tbc1d1磷酸化的AMPK依赖性降解分别通过增强葡萄糖转运蛋白（GLUT）（如Glut1和Glut4）的质膜定位来促进葡萄糖利用。此外，DHT可能通过AMPK激活抑制乙酰辅酶A羧化酶α，导致脂质合成减少，脂肪酸进入线粒体进行β氧化增加（图5B，5C）。
此外，DHT可以通过调节AMPK和mTOR途径来维持线粒体稳态（图6）。我们在S555观察到unc-51样自噬激活激酶1（Ulk1）的过度磷酸化（图5B），这是AMPK直接靶向的残基，以及在S129观察到线粒体分裂因子（Mff）的上调磷酸化（见图5B），后者是线粒体分裂的关键因子，也是AMPK的直接靶点。几项研究表明，Ulk1和Mff的磷酸化通过线粒体自噬促进功能失调线粒体的分离和去除。此外，AMPK激活已被证明可以减少IR过程中线粒体通透性转换孔的开放，可能是通过减少氧化应激。
此外，值得探索DHT和AMPK之间直接结合的可能性。然而，我们目前的蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据的结果不足以得出结论。然而，DHT对心肌细胞线粒体复合体I的抑制作用，先前已有报道。先前的研究表明，抑制线粒体功能可以刺激AMPK信号通路的激活，例如二甲双胍对AMPK的激活。因此，DHT也有可能通过抑制复合物I来激活AMPK信号通路。这也许是我们今后研究的一个值得探索的方向。此外，研究细胞中与DHT直接相互作用的靶蛋白也很重要，这可能为治疗心肌IR损伤提供潜在的药物靶点。我们可以考虑使用其他靶点发现策略，如基于活性的蛋白质分析（ABPP）和细胞热位移分析（CETSA），以在未来进一步探索DHT靶点。
研究表明，DHT在动物模型中显示出心脏保护作用，超声心动图显示心肌功能改善，梗死面积缩小。此外，其他研究发现，DHT可以缓解高脂肪饮食引起的心脏肥大和舒张功能障碍。在骨骼成肌细胞、胰岛素瘤细胞和脂肪细胞的细胞模型中，DHT已被证明可以激活AMPK并增加葡萄糖摄取。此外，DHT已被发现在其他疾病模型中具有有益作用，可以减少肾、肺和肝等关键器官的损伤和炎症。然而，目前尚不清楚DHT的保护作用是否是通过AMPK信号通路在这些组织中介导的，有必要进一步研究这种关系。尽管高剂量的DHT治疗已被证明对小鼠没有显著毒性，但仍需要对其急性和慢性毒性进行更系统的研究，以确认DHT的安全性。
我们的研究提出了一种新的研究方法，通过在全蛋白质组内定量分析药物或天然产物调节的磷酸化修饰，能够系统阐明细胞信号通路及其下游表型效应。随着质谱硬件、样品制备技术和集成分析平台的快速发展，这种全蛋白质组分析为药物发现提供了理想的策略。它允许比较类似化合物对细胞或动物模型中数千种蛋白质的影响。例如，TMT-16 plex技术可以在不影响数据质量的情况下通过增加样本量来提高吞吐量。
结论
总之，我们的综合方法测量了大量蛋白质和磷酸化位点的丰度，能够识别参与IR损伤的关键信号通路，并对丹参中各种生物活性化合物的作用提供了全面的了解。我们的全蛋白质组分析强调了DHT调节AMPK/mTOR信号通路的能力，从而维持线粒体动力学并实现细胞合成代谢和分解代谢之间的平衡。这些发现揭示了DHT心脏保护作用的潜在机制。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711323002581?via%3Dihub
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