导读
如达-6（RD-6）是一种经典的蒙古传统中药配方，由6种草药组成，传统上用于治疗胃部疾病。尽管在动物模型中已经证明它可以预防胃溃疡（GU），但肠道微生物组和血清代谢组相关的胃溃疡预防机制尚不清楚。本研究旨在评估RD-6与GU大鼠肠道微生物组和血清代谢谱改变相关的胃保护机制。在使用吲哚美辛（30mg/kg，单次口服剂量）诱导胃溃疡之前，大鼠口服RD-6（0.27、1.35和2.7g/kg）或雷尼替丁（40mg/kg）三周。我们定量测定胃溃疡指数、溃疡面积、H&E染色以及TNF-α、iNOS、髓过氧物酶（MPO）和丙二醛（MDA）水平，以评估RD-6的溃疡抑制作用，并将16S rRNA基因测序与LC-MS代谢谱相结合，研究RD-6对大鼠肠道微生物群和血清代谢产物的影响。此外，Spearman分析用于计算差异微生物群和代谢物之间的相关系数。RD-6可抑制吲哚美辛对大鼠的胃损伤，使溃疡指数下降50.29%（p<0.05），降低胃组织中TNF-α、iNOS、MDA和MPO的水平。此外，RD-6重塑了多样性和微生物组成，并逆转了减少的细菌，包括[真细菌]_xylanophilum group、Sellimonas、脱硫弧菌和UCG-009，以及吲哚美辛诱导增加的水微菌属。此外，RD-6调节包括氨基酸和有机酸在内的代谢产物的水平，这些受影响的代谢产物参与牛磺酸和亚牛磺酸的代谢以及色氨酸的代谢。Spearman分析显示，肠道微生物群紊乱与血清差异代谢物的变化密切相关。结合16S rRNA基因测序和LC-MS代谢结果，本研究提出了RD-6通过调节肠道菌群及其代谢产物改善GU的机制。
研究热点：
1. RD-6显著减轻吲哚美辛引起的胃溃疡；
2. RD-6改善了炎症反应和氧化应激因子的水平；
3. RD-6重塑了肠道微生物群的多样性、微生物组成和丰度；
4. RD-6调节血清代谢产物的水平，包括氨基酸和有机酸，这些代谢产物参与调节牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及色氨酸代谢；
5. RD-6的胃保护机制可能与肠道微生物组及其相关代谢产物的调节有关。
论文ID
原名：Mongolian medicine formulae Ruda-6 alleviates indomethacin-induced gastric ulcer by regulating gut microbiome and serum metabolomics in rats
译名：蒙药方如达-6通过调节肠道微生物组和血清代谢组学减轻吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.05
通讯作者：陈永胜，付明海
通讯作者单位：内蒙古民族大学&海南医学院
实验设计
实验结果
1. LC-MS/MS法测定RD-6的主要成分
LCMS/MS获得的RD-6的基峰强度（BPI）色谱图如图S1所示，我们分别在负离子模式和正离子模式下共鉴定出131种和153种化合物。其中，表2中列出了16种相对百分比高于1%的化合物。胡椒碱含量最高，占13.96%。在RD-6提取物中，16种已鉴定化合物的总含量达到48.86%。
表1 RD-6的药用成分
图1 RD-6对吲哚美辛诱导的胃溃疡大鼠胃黏膜的保护作用。将大鼠分为正常对照组（NC）、模型组（IND）、雷尼替丁组（RAN）、RD-6低剂量组（RD-6-L）、RD-6-中剂量组（RD-6-M）和RD-6高剂量组（RDS-6-H）。（A）动物实验工作流程图；（B）胃黏膜损伤图；（C）胃溃疡指数。数据表示为平均值±标准差（n=10）。与NC组相比，###P＜0.001；与IND组相比，***P＜0.001。（D）胃组织的组织病理学变化。组织切片用苏木精和伊红（H&E）染色。红色箭头：出血；黑箭头：组织病理学病变。
2. RD-6对GU大鼠胃组织的影响
首先，我们通过观察胃组织形态学变化、评估溃疡指数和评估病理变化，评估RD-6对吲哚美辛诱导的GU模型大鼠的疗效。如图1B所示，与NC组相比，吲哚美辛灌胃引发了大量线性和点状出血性病变，表明GU模型已成功建立。与IND组相比，RD-6和雷尼替丁处理明显减少了这种损伤，尤其是在RD-6-H组。
溃疡指数的统计结果与形态学观察结果一致（图1C），IND组的溃疡指数最大。然而，与IND组相比，每个治疗组都可以抑制吲哚美辛引发的损伤程度。其中，RD-6-H组溃疡指数最低，抑制率最高（50.29%，p<0.05）。
表2 LC-MS/MS法测定RD-6的主要成分
图2 大鼠胃中TNF-α（A）、iNOS（B）、MDA（C）和MPO（D）水平。数值以平均值±标准差（n=10）表示。与NC组相比，#P<0.05、##P<0.01和###P<0.001；与IND组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
我们然后在解剖后取出胃组织，并用H&E染色（图1D）。不出所料，与正常动物的组织相比，吲哚美辛刺激导致了明显的组织学变化，包括出血性损伤、上皮细胞损失和炎症细胞浸润。然而，与IND组相比，所有处理组均表现出保护作用，病理恶化程度有所减轻。上述结果表明，RD-6对吲哚美辛诱导的大鼠GU有一定的保护作用。
表3 三组大鼠粪便样本的α多样性指数（平均值±标准差）
图3 三组肠道微生物群的细菌群落多样性分析结果。（A）基于OTUs的三组Venn图；（B）稀疏曲线；（C）秩丰度；（D）肠道微生物群的PCoA分析评分图；（E）肠道微生物群在门水平上的群落丰度。RD-6组代表RD-6高剂量组（2.7g/kg体重）。
3. RD-6对GU大鼠炎症和氧化应激指标的影响
为了进一步评估RD-6的胃保护作用，我们对与胃黏膜炎症和氧化应激相关的几个参数进行了量化（图2）。结果发现，吲哚美辛可增加胃TNF-α、iNOS（p<0.01）、MDA（p<0.001）和MPO（p<0.05）含量。与IND组相比，雷尼替丁和RD-6降低了胃粘膜组织中TNF-α、iNOS（p<0.01）和MDA（p<0.001）的水平。此外，只有高剂量的RD-6才能抑制IND诱导的胃MPO（p<0.05）。这些结果进一步表明，RD-6对吲哚美辛引发的胃损伤具有很强的保护作用。
图4 RD-6在科（A）和属（B）水平上对肠道微生物群相对丰度的影响。数据以平均值±标准差（n=7）表示。*p＜0.05；**p<0.01。
4. RD-6重建了肠道菌群的结构和组成
为了确定肠道微生物群的物种组成和群落结构，我们采用16S rRNA高通量测序技术，通过Illumina NovaSeq平台对NC、IND和RD-6（2.7g/kg）组的大鼠盲肠粪便样本进行分析。我们共获得1772588个原始reads，平均长度为412bp。在质量控制过滤之后，每个样本平均获得82698个有效数据。我们将序列聚类为具有97%同一性的OTUs（操作分类学单元），共鉴定了3350个OTUs，并通过分类学分析获得了17个门、149个科和323个属的微生物群落信息。使用维恩图，我们可以直观地理解群体之间共同和独特的OTUs。从图3A中可以看出，在3350个OTUs的总丰富度中，所有组共享1020个。此外，稀疏曲线达到了一个平稳期，并随着样本测序量的增加而趋于饱和，物种数量不再线性或快速增加，表明有合理数量的测序数据（图3B）。并且三组斜率的秩丰度呈现出一致的趋势，这表明测序深度足以反映群落的微生物多样性（图3C）。我们计算观察到肠道微生物群的物种Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数，以估计α-多样性指标，分析结果列于表3中。与NC组相比，吲哚美辛处理后，观察到的物种、Chao1和ACE指数下降，表明IND组肠道微生物群的微生物丰富度低于NC组（p>0.05）。此外IND组的Shannon和Simpson指数也有所下降（p>0.05），表明肠道微生物群的多样性降低。与IND组相比，RD-6组观察到的物种、Chao1、ACE和Shannon指数增加，表明RD-6在保护肠道微生物群多样性方面具有潜在作用（p>0.05）（表3）。我们还进行了主坐标分析（PCoA）图，以比较微生物群落之间的β-多样性（图3D）。通过观察三组在PCoA图上的分布，我们发现IND组与NC组相比有显著的变化，而RD-6组与IND组不能明显分离，这表明吲哚美辛影响了肠道微生物组成，口服RD-6在一定程度上改善了GU大鼠的肠道微生物组。上述结果表明，RD-6部分恢复了GU大鼠肠道微生物群落的丰富度和多样性，但对肠道微生物群的β-多样性指标影响有限。
为了进一步分析RD-6对肠道微生物群组成和结构的影响，我们对不同水平的肠道微生物群中差异细菌的相对丰度进行了统计分析。门水平分析显示，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门的数量最多，占所有组中种群的大多数（图3E）。然后，我们比较了不同类群在科属水平上的微生物差异，在NC组和IND组的肠道微生物群中鉴定出三个不同的科和五个不同的属（p<0.05）（图4）。NC组毛螺菌科、脱硫弧菌科、Butyricicoccaceae、[真细菌]_xylanophilum group、Sellimonas、脱硫弧菌和UCG-009的相对丰度显著增加（p<0.05），而IND组水微菌属的相对丰度则显著增加（p<0.05）。服用RD-6后，与IND组相比，这些属的相对丰度被调节到接近正常水平。此外，与NC组相比，IND组Limosilactobacillus的相对丰度上调，GCA-900066575和Prevotellaceae_NK3B31 group下调（p>0.05），而在RD-6组中它们具有统计学上显著的变化（p＜0.05）。这些结果表明，RD-6将GU大鼠的微生物微生态失调逆转至正常水平。
此外，我们获得各组大鼠肠道微生物群的功能注释和丰度信息，绘制热图，并根据功能差异水平进行聚类。根据图5，吲哚美辛诱导后，与氨酰基tRNA生物合成、氨基酸相关酶、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢相关的细菌代谢途径呈显著上升趋势。当用RD-6处理大鼠时，上述途径显示出相反的趋势，这表明RD-6可能通过调节具有不同功能及其丰度的肠道微生物群，在预防GU方面发挥作用。
图5 Tax4fun功能注释聚类热图。纵坐标表示功能注释，横坐标为样本信息（NC，正常对照组；IND，模型组，RD-6，RD-6高剂量组）。红色和蓝色分别表示组中功能的相对丰度较高和较低。
5. 大鼠血清中特征代谢物的鉴定及相关代谢途径
我们对血清样本进行非靶向代谢组学分析，以进一步揭示NC、IND和RD-6（2.7g/kg）组的内源性代谢谱。主成分分析（PCA）得分图显示，三组的代谢谱在正离子和负离子模式下显著分离（图6A–B），表明这些组之间存在显著差异。我们使用OPLS-DA分析进一步表征代谢物紊乱，如图6C-D所示，在正离子和负离子模式下，NC、IND和RD-6组的得分图表现出不同的样式，并且每组都是聚类的，表明这三组是有区别的，并且表现出良好的重复性。
基于OPLS-DA模型，我们筛选出正离子和负离子模式下的潜在差异代谢物。如图6E–G和表4所示，NC、IND和RD-6组分别有59种和126种差异代谢物。此外，与正常大鼠相比，吲哚美辛诱导大鼠的59种差异代谢物中分别有33种和26种表现出明显的增加和减少。然而，RD-6显著调节了59种差异代谢物中的38种，并使27种差异代谢物达到正常水平，这表明这27种代谢物与RD-6高度相关（图6G，表4）。例如，IND组的熊去氧胆酸、牛磺胆酸、L-色氨酸、L-半胱氨亚磺酸、5-羟吲哚乙醛和吲哚乙醛水平显著高于NC组（p<0.05），而RD-6可以将其恢复到接近正常水平（p<0.05）（图6H–M）。此外，上述38种差异代谢产物的热图显示出明显的聚类，其中代谢变化主要分布在有机酸及其衍生物（10/41）、氨基酸及其代谢产物（6/41）和杂环化合物（6/11）中（图7）。
然后我们选择差异代谢产物来研究吲哚美辛诱导的GU和RD-6处理影响的最相关途径。IND组的两种主要代谢途径发生了变化，包括牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及色氨酸生物合成（影响因子>0.1和p<0.05）（图8A）。然而，RD-6恢复了牛磺酸和亚牛磺酸的代谢途径（影响因子>0.1和p<0.05）（图8B）。此外，RD-6组的色氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢、咖啡因代谢、酪氨酸代谢和鞘脂代谢也是潜在的途径（影响因子>0.1和p>0.05）。
表4 NC大鼠与GU大鼠、GU大鼠与RD-6给药后的代谢物差异
图6 GU大鼠RD-6的非靶向代谢分析。正离子模式（A）和负离子模式（B）下的主成分分析得分图，混合表示质量控制样本；（C）负离子模式下的OPLS-DA评分图；（D）正离子模式下的OPLS-DA评分图；（E）NC组和IND组之间代谢物的火山图；（F）IND组和RD-6组之间代谢物的火山图；（G）不同代谢物的维恩图。有机酸（熊去氧胆酸和牛磺胆酸）（H–I）、氨基酸（L-色氨酸和L-半胱氨亚磺酸）（J–K）和杂环化合物（5-羟吲哚乙醛和吲哚乙醛）（L–M）的变化。RD-6组代表RD-6高剂量组（2.4 g/kg BW）。数据以平均值±标准差（n=7）表示。与IND组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
6. 肠道微生物组与血清代谢组的相关性分析
最后，我们进行了进一步的分析，以探索通过16S rRNA基因测序分析获得的肠道微生物群落与通过LC-MS分析获得的血清代谢物之间的潜在关系。差异细菌种群的相对丰度（图4）和差异代谢物（图7，表4）被用于进行Spearman相关性分析。热图中显示了肠道微生物群的相对丰度与GU诱导和RD-6处理影响的血清代谢物之间的相关系数（r>0.6或<-0.6）（图9）。我们发现一些细菌与各种代谢产物有很强的相关性。其中一些代谢产物被称为某些肠道微生物群菌株的共代谢产物，可以直接参与微生物代谢。例如，Prevotellaceae NK3B31 group的丰度通过RD-6干预上调，其变化与Arg-Thr-Lys-Arg呈负相关（r=-0.629，p=0.002），而与9-芴酮呈正相关（r＝0.663、p＝0.0001）。RD-6上调了GCA-900066575的丰度，其变化与Hept-trans-2-en-1-yl acetate呈负相关（r=-0.602，p=0.004），与1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-myo-inositol)呈正相关（r=0.711，p<0.001）。此外，Limosilactobacillus的丰度受RD-6的下调，并与Methylnorlichexanthone（r=0.701）、Hept-trans-2-en-1-yl acetate（r=0.648）、吲哚乙醛（r=0.647）等呈正相关，与2-Methyl-3-furanthiol（r=−0.649）和1-Stearoyl-2-arachidonoylsn-glycero-3-phospho-(1′-myo-inositol)（r=–0.828）呈负相关（均p<0.05）。
图7 三组差异代谢物的分层聚类图。纵坐标表示显著差异表达的代谢。（MW0013133表示2,4,6-Trihydroxy-5-[1-(4-hydroxy-1,1,4,7-tetramethyl-1a,2,3,4a,5,6,7a, 7b-octahydrocyclopropa [h]azulen-7-yl)-3-methylbutyl]benzene-1,3-dicarbaldehyde），横坐标表示组信息。红色和绿色分别表示每个样本中上调和下调的代谢物。
图8 GU大鼠差异代谢产物的代谢途径分析。（A）NC组与IND组；（B）IND与RD-6组（a，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢；b，甘油磷脂代谢；c，咖啡因代谢；d，酪氨酸代谢；e，鞘磷脂代谢）。（C）RD-6改善吲哚美辛诱导的GU大鼠的主要机制。红色和绿色字表示与模型组相比，RD-6治疗组的显著增加和减少的代谢物。
讨论
本研究探讨了RD-6对GU大鼠的胃保护作用。我们报道了RD-6的抗炎和抗氧化特性，以及它对肠道微生物群和血清代谢产物的影响。通过对大鼠施用吲哚美辛建立疾病模型，以模拟过量使用非甾体抗炎药诱导的人类GU。我们的研究表明，吲哚美辛（30mg/kg）刺激会导致大鼠胃黏膜出现严重的病理生理和形态学异常，这与之前的报道一致。研究结果表明，吲哚美辛给药与炎症和氧化还原平衡有关，如TNF-α、iNOS、MDA和MPO水平升高。RD-6预防性给药三周后，胃损伤程度减轻，尤其是高剂量（2.7g/kg）组的溃疡抑制率达到近50%；此外，iNOS含量恢复到接近正常水平，TNF-α、MDA和MPO水平不同程度下降。微生物组和代谢组学数据显示，RD-6恢复了吲哚美辛诱导的GU大鼠肠道微生物群和相关代谢产物。Spearman分析表明，肠道微生物群紊乱与几种相关代谢产物的变化密切相关，表明在药物干预下与肠道微生物相关的代谢产物可能调节宿主组织功能并改善GU。这些结果表明，RD-6预防GU的机制可能是通过调节肠道微生物群及其代谢产物。
肠道微生物群在GU中的重要作用已被广泛接受，GU对微生物群的破坏与发病机制密切相关。最近一项对大鼠粪便微生物群分析的研究表明，GU大鼠中变形杆菌的相对丰度增加，而放线菌和疣微菌与对照组相比有所减少。另一项研究报告称，GU大鼠的肠道微生物组失调，并发现可以调节牛磺酸和色氨酸代谢的拟杆菌在GU大鼠的粪便样本中受到显著抑制。在本研究中，我们注意到GU大鼠肠道微生物群的丰度和多样性是显著变化的，RD-6处理的大鼠显示出微生物群落的恢复。根据先前的研究，我们的研究中观察到了肠道微生物群在门水平上的结构组成，在GU相关微生物群中观察到拟杆菌门、变形菌门的富集和厚壁菌门的减少。虽然这些门的数量在RD-6处理组中没有显著变化，也就是说，RD-6恢复肠道微生物群结构的能力不能在门水平上得到反映。因此，我们在科属水平上分析了三组的差异细菌，发现了几种可能与RD-6对于GU的治疗和预防效果有关的细菌。
图9 不同肠道微生物群和不同代谢产物之间的相关性。横坐标表示不同的肠道微生物群，纵坐标表示不同代谢产物。颜色范围从红色（正相关）到蓝色（负相关）。显著差异用星号标记（*p<0.05，**p<0.01和***p＜0.001）。
在GU大鼠中，包括毛螺菌科、脱硫弧菌科和Butyricicoccaceae在内的菌科减少，而在RD-6处理的大鼠中则相反。其中，毛螺菌科可能主要对适应性变化的菌群保护作用有贡献，因为其相对丰度最高。毛螺菌科可以产生不同类型的短链脂肪酸（SCFAs），如丁酸，通过维持胃肠黏膜完整性和减少肠道有害菌的生长，有助于改善宿主健康。与科水平的变化一致，毛螺菌科的四个属（[真细菌]_xylanophilum group、Sellimonas、GCA-900066575和Prevotellaceae_NK3B31 group）在GU大鼠中也下调，在RD-6给药组中上调。先前有报道称，[真细菌] _xylanophilum group的相对丰度与辐射诱导的肠道损伤呈负相关。根据我们的研究，在模型大鼠中，[真细菌] _xylanophilum group的相对丰度较低（p<0.05），而RD-6可以抑制其丰度的降低，但尚未达到统计学意义。因此，RD-6可能通过这些细菌的发酵发挥胃保护作用。与正常大鼠相比，吲哚美辛导致GU模型中脱硫弧菌科和脱硫弧菌属显著减少。脱硫弧菌科是肠道中主要的硫酸盐还原菌，通常将硫酸盐转化为硫化氢（H2S）。研究表明，H2S参与了许多生理和病理过程，如减轻内脏疼痛和炎症性疾病。其他研究报告称，抑制H2S合成可能导致对上皮/黏膜损伤的易感性增加，促炎细胞因子的表达增加，以及环氧合酶-2（COX-2）的表达减少。因此，可以推测，RD-6大鼠体内恢复的脱硫弧菌可能具有在GU过程中缓解炎症和促进伤口愈合的潜力。此外，Butyricicoccaceae与黏膜抗炎作用密切相关。我们发现Butyricicoccaceae和UCG-009在GU大鼠中显著减少，在RD-6处理大鼠中增加，这表明RD-6具有潜在的抗炎作用。
此外，大鼠血清的代谢组学分析揭示了一些与GU相关的代谢途径和潜在的生物标志物。结果表明，牛磺酸和hypothalamine代谢途径似乎是GU模型大鼠最受扰乱的途径，包括L-半胱氨亚磺酸和牛磺胆酸。牛磺酸在胆汁酰基辅酶A（BAAT）的作用下形成牛磺胆酸，可减弱胃肠运动，使胆汁流回胃，破坏胃黏膜屏障。此外，研究发现，吲哚美辛诱导的肠道损伤大鼠的牛磺胆酸盐增加，并与MPO呈正相关。本研究中吲哚美辛处理的大鼠牛磺胆酸盐和MPO含量均显著增加，表明牛磺胆酸盐的变化与GU发生过程中的氧化应激有关。RD-6的干预恢复了GU大鼠牛磺胆酸盐和MPO的异常变化，提示RD-6调控了牛磺胆酸盐从而缓解了GU损伤。
色氨酸是人体内一种重要的芳香族氨基酸。研究表明，色氨酸及其代谢紊乱可导致神经系统功能障碍，从而影响胃肠功能。我们发现，L-色氨酸在GU大鼠中显著增加，其代谢产物吲哚乙醛和5-羟吲哚乙醛（5-HIAL）的水平也有相同的变化，这表明吲哚美辛可能通过5-羟色胺途径和吲哚衍生物代谢途径引起胃黏膜损伤。RD-6处理后这三种代谢产物与GU组相比呈下降趋势，表明RD-6可能通过恢复色氨酸代谢紊乱而在胃黏膜中发挥保护作用。
此外，我们还发现RD-6对GU的预防作用可能涉及其他代谢途径的调节，如半胱氨酸和甲硫氨酸代谢（L-甲硫氨酸）、咖啡因代谢（1-甲基黄嘌呤）和酪氨酸代谢（多巴胺）。据报道，吲哚美辛诱导的胃溃疡大鼠体内蛋氨酸含量降低。根据我们的研究结果，RD-6可增加大鼠甲硫氨酸水平，这可能有助于其胃黏膜保护功能。在黄嘌呤氧化酶的作用下，1-甲基黄嘌呤转化为1-甲基尿酸，从而通过炎症细胞的积聚引起内皮损伤。在我们的研究中，RD-6可以通过减少1-甲基黄嘌呤来减轻GU大鼠的胃黏膜损伤。此外，多巴胺在胃溃疡的发生和发展中起着至关重要的作用。我们发现，与GU大鼠相比，RD-6大鼠的多巴胺水平显著降低，这一点值得注意，因为之前的研究表明，刺激实际上会增加多巴胺的释放。据报道，细菌可以产生一系列神经递质，这些神经递质可能与微生物群-肠-脑轴有关。因此，我们有理由推测RD-6对多巴胺和肠道微生物群的调节有利于缓解胃溃疡。
结论
总之，我们的研究结果表明，RD-6对吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡具有保护作用，这可归因于对炎症（TNF-和iNOS）、氧化应激（MPO和MDA）和胃黏膜保护的调节。此外，RD-6调节肠道微生物群失调，如毛螺菌科、脱硫弧菌科和Butyricicoccaceae。这些特征可能与受肠道微生物群影响的一系列代谢产物变化有关，包括牛磺酸和hypothalamine代谢以及色氨酸代谢。值得注意的是，微生物群与代谢产物之间的相关性可能为探索RD-6的预防效果提供新的视角。总的来说，RD-6可以通过调节肠道微生物群及其相关代谢产物从而缓解GU。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37196816/
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