导读
《神农本草经》中记载了柏子仁，经长期用药后被认为是一种毒性较低的草药。含有柏子仁的多种中药处方已被用于治疗失眠。现代临床通常使用柏子仁治疗焦虑症，但对其成分和抗焦虑机制的研究很少。本研究旨在描述柏子仁的主要成分，并探讨其抗焦虑作用及其机制；采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气相色谱-色谱联用（GC-MS）对柏子仁的主要成分进行了表征；在慢性不可预知温和应激（CUMS）诱导的小鼠中评估口服柏子仁的抗焦虑作用。为了探究柏子仁的抗焦虑机制，我们进行了血清非靶向代谢组学与网络药理学和分子对接相结合的研究，在50%甲醇提取物中鉴定出14种化合物，在柏子仁的甲酯化脂肪油中鉴定出11种脂肪酸衍生物。在CUMS小鼠中，柏子仁的水提取物（BZR）和脂肪油（OBZR）都具有抗焦虑作用；血清非靶向代谢组学鉴定出34种差异代谢物，富集了鞘脂代谢、甾体生成、α-亚油酸和亚油酸代谢等脂质代谢途径；网络药理学鉴定了柏子仁主要成分的109个靶点，富集了“神经活性配体-受体相互作用”和“脂质代谢”。分子对接结果表明，柏子仁中的主要成分可以与过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARD）、过氧化物酶物增殖物激活的受体α（PPARA）、脂肪酸结合蛋白5（FABP5）、脂肪酸结合蛋白3（FABP3）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）和脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）等关键靶点结合。本研究表明，柏子仁具有抗焦虑作用，其抗焦虑机制可能是调节脂质代谢和神经活性配体-受体相互作用。
研究热点：
1. 对柏子仁50%甲醇提取物和油的成分进行了鉴定；
2. 与传统的柏子仁使用方法一致，50%甲醇提取物和柏子仁油都具有抗焦虑作用；
3. 脂代谢和神经活性配体-受体相互作用可能是柏子仁潜在的抗焦虑机制。
论文ID
原名：Integration of non-targeted metabolomics with network pharmacology deciphers the anxiolytic mechanisms of Platycladi Semen extracts in CUMS mice
译名：将非靶向代谢组学与网络药理学相结合，揭示了柏子仁提取物对CUMS小鼠的抗焦虑机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.05
通讯作者：黄建梅，王灿
通讯作者单位：北京中医药大学
实验设计
实验结果
1. 柏子仁中的主要成分
UHPLC-Q Exactive/MS用于分析柏子仁50%甲醇提取物，并在正离子和负离子模式下获得基峰离子（BPI）色谱图（图1A和B）。通过数据库比较，我们从柏子仁50%甲醇提取物中鉴定出14种化合物（表1）。其中包括七种脂肪酸、一种脂肪酰胺、黄酮类化合物、羧酸类、萜类化合物和低聚糖类。先前报道了柏子仁的非脂肪油部分存在两种烷基醇酰胺，但在我们的提取物中未检测到。OBZR甲基化后，我们通过GC-MS鉴定出12种脂肪酸衍生物，包括9种不饱和脂肪酸和2种饱和脂肪酸（图1C，表2）。脂肪酸衍生物包括亚麻酸、亚油酸和5,11,14-二十碳三烯酸，这是OBZR的主要成分（见表2）。
表1 柏子仁50%甲醇提取物成分的鉴定
图1 柏子仁成分的LC-MS和GC-MS分析
用UHPLC-Q Exactive/MS对柏子仁50%甲醇提取物的正模式（A）和负模式（B）的基峰色谱图。（C）OBZR的GC-MS总离子色谱图。
表2 OBZR中成分的鉴定
ref RI：来自NIST化学WebBook的数据。
表3 非靶向代谢组学方法评估
2. 柏子仁的抗焦虑作用
我们使用旷场实验（OFT）和高架十字迷宫（EPM）评估BZR和OBZR的抗焦虑作用。OFT被用于评估一个新异环境中的动物运动。EPM用于评估动物的焦虑样行为，使用代表危险的开放臂和代表安全环境的闭合臂。我们使用CUMS方案处理小鼠7周，并在行为测试前给药6周（图2A）。尽管动物体重没有出现显著差异（图2B），但接受地西泮和OBZR治疗的小鼠在OFT和EPM中表现出较低水平的焦虑。口服OBZR后，小鼠在OFT的中心区域停留的时间更长，整个开阔区域的总运动距离没有增加（图2C和D）。模型组动物在OFT期间没有表现出类似焦虑的行为（p = 0.051)，这可能是由动物对CUMS的不同敏感性引起的。EPM的结果表明，口服BZR和OBZR可以显著增加小鼠进入开放臂的时间和频率（OT%，OE%）（图2E和F）。但使用氟西汀在EPM中并没有显示出良好的抗焦虑作用。这些结果表明，BZR和OBZR改善了CUMS后小鼠的焦虑样行为。
图2 BZR和OBZR在CUMS小鼠中的抗焦虑作用
（A）展示了操作方案，整个实验持续了7周。在适应性饲养3天后，模型组（Mod）、氟西汀组（Flu）、BZR组（BZR）和OBZR组（OBZR）的小鼠用CUMS方案处理1周，然后分别口服生理盐水、氟西汀、BZR和OBZR共6周。（B）整个实验中小鼠的体重。进行了OFT（C–D）和EPM（E–F）。Ctrl：对照组；Mod：模型组；Flu：氟西汀组；BZR:BZR组；OBZR:OBZR组。与对照组相比，#p < 0.05，##p < 0.01，###p<0.005。*与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p < 0.005。
3. 非靶向代谢组学
3.1 方法评估
结果表明，保留时间（RT）和峰面积（PA）的RSD分别小于3%和15%，表明仪器精度、方法精度和样品稳定性良好。
3.2 多元统计分析
UPLC-Q-TOF/MS用于分析不同组小鼠血清样品的非靶向代谢组学。质量控制（QC）样品和每组样品在正离子和负离子模式下BPI色谱图如图3所示。我们对所有组样品进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），每组样品可以相互分离（图4），表明小鼠体内某些代谢物的水平在病理条件下发生了变化。OPLS-DA模型显示，R2和Q2符合要求（表4）。置换检验结果表明，该模型稳定可靠，可用于进一步的数据分析。
图3 血清样品的UHPLC-Q-TOF/MS BPI色谱图
显示了血清代谢物的正离子模式（A）和负离子模式（B）色谱图。色谱分离在C18反相柱上进行。色谱峰主要分布在3-10min之间 。（i）Ctrl；（ii）Mod；（iii）Flu；（iv）BZR；（v）OBZR；（vi）质量控制。
图4 多变量统计分析结果
横轴是第一主成分的得分，即预测主成分，用t[1]表示，纵轴是第二主成分，即正交主成分的分数，用t[2]表示。图显示了五组的正离子模式（A）和负离子模式（B）。A-i：五组的OPLS-DA结果。A-ii：Mod与Ctrl。A-iii：Mod与Flu。A-iv Mod与BZR。A-v:Mod与OBZR。A-vi：BZR与OBZR。
表4 多元统计分析
3.3 差异代谢产物的筛选和鉴定
我们通过与原始数据中的二级碎片进行比较来筛选和鉴定代谢物。我们从HMDB数据库中检索标准谱库或理论碎片库，并鉴定出34种不同的代谢物。与对照组相比，Mod中的鞘氨醇和3-脱氢鞘氨醇减少。模型组维生素K12,3-环氧化物、PC（20:5/16:0）、PC（20-3/18:3）、二十碳二烯酸、N-(5-氨基戊基)乙酰胺、5-羟基苯酚、皮质醇、皮质酮、顺式-4-辛二酸、LysoPC（15:0/0:0）、LysoPC（16:1/0:0）、LysoPC（18:3/0:0）、LysoPC、4-羟基苯基丙酮酸、PG（18:0/20:4）和孕烯醇酮升高。各组差异代谢产物的具体信息和趋势如表5和图5所示。
表5 差异代谢物的变化趋势
*与Ctrl组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005；#与Mod组相比，# p<0.05，##p<0.01，###p<0.005，####p<0.001；&与BZR组相比，&p<0.05，&&p<0.01。
图5 五组之间差异代谢产物的热图
确定了五组之间的差异代谢产物。红色表示差异代谢物的含量相对较高，蓝色表示差异代谢物含量相对较低。
3.4 代谢途径分析
我们分析模型组和处理组小鼠的差异代谢物。它们与鞘脂代谢、甾体生成、维生素K代谢、α-亚麻酸和亚油酸代谢、酪氨酸代谢、纤溶酶合成、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、磷脂生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、花生四烯酸代谢有关（图6）。
图6 MetaboAnalyst对血清差异代谢产物的富集分析
横轴是富集率，表示富集的靶标占相应信号通路中所有靶标的百分比。
4. 网络药理学分析
我们在柏子仁50%甲醇提取物中和OBZR中鉴定的成分用于网络药理学分析，对柏子仁的主要成分进行焦虑症常见靶点筛选，共获得109个共有靶点；将组分和靶点导入Cytoscape以生成成分-靶点相互作用网络，该网络产生130个节点和257个相互关系（图7A）。排在前五位的成分是槲皮素、帕拉金糖、邻苯二甲酸二辛酯、癸酸和硬脂酸。共享靶点被导入STRING数据库，用于在线PPI分析。图中的“边”表示交叉基因之间的关联程度，因此，关联越大，节点代表交叉基因的潜力就越大。我们共识别了151个节点和747条边（图7B），前7个位置为PPARD、PPARA、FABP5、FABP3、PPARG、ALOX5和FAAH。《京都基因与基因组百科全书》（KEGG）信号通路富集分析表明，柏子仁靶点参与神经活性配体-受体相互作用、类固醇激素生物合成、磷脂酶D信号通路、多巴胺能突触、脂肪细胞脂解调节和逆行内源性大麻素。GO富集分析表明，细胞对脂质、神经元和突触的感知和利用、膜筏、受体配体活性和生物膜主要相关（图7C）。这些结果表明，柏子仁的主要成分对脂质代谢和神经元功能的调节具有调节作用，这可能是柏子仁提取物的抗焦虑机制。
图7 网络药理学分析结果
（A）柏子仁主要成分和共享靶点的网络拓扑分析。（B）共同靶点的PPI分析。（C）生物功能分析，（i）KEGG通路富集分析，（ii）显著富集的分子功能，（iii）显著富集的生物过程，（iv）显著富集的细胞成分。
5. 分子对接结果
我们使用Autodock-vina软件将五种活性成分与PPI网络中的7种核心蛋白对接（表6，图8）。配体与受体的结合越稳定，所显示的结合能就越低。当结合能小于−5.0时，分子对靶点具有更好的结合活性，结合能低于−7.0，分子与靶点结合得更好。结果表明，槲皮素与七种核心蛋白的结合较好，结合能小于或接近−7.0。这七种核心蛋白可以与帕拉金糖结合，帕拉金糖是一种低聚糖成分，在肠道中被酶分解为葡萄糖和果糖，通常不会作为原型进入人体，但之前的研究发现，静脉注射帕拉金糖对血糖、脂质和胰岛素水平的影响比同等剂量的蔗糖小得多。
表6 分子对接的结合能
a不存在H键
图8 核心蛋白与槲皮素和帕拉金糖的分子对接
（A）槲皮素与PPARD；（B）槲皮素与FABP5；（C）帕拉金糖与FABP3；（D）槲皮素与ALOX5。核心蛋白的结合口袋如左图所示。中间图显示了含有槲皮素和帕拉金糖的核心蛋白的符合图，黄色虚线表示氢键。含有槲皮素和帕拉金糖的核心蛋白平面结构如右图所示，紫色箭头表示氢键。
讨论
柏子仁的水提取物和脂肪油在CUMS小鼠中都显示出抗焦虑作用。为了阐明柏子仁抗焦虑的物质基础，我们鉴定了柏子仁的主要成分，包括脂肪酸、黄酮类化合物和低聚糖。为了研究柏子仁在抗焦虑方面的潜在抗焦虑机制，我们进行了代谢组学、网络药理学和分子对接。结果表明，抗焦虑作用可能是通过影响脂质代谢和神经活性配体-受体相互作用产生的。
除黄酮类和低聚糖外，我们在柏子仁中还鉴定出亚麻酸、亚油酸和5,11,14-二十碳三烯酸等多种不饱和脂肪酸。之前的一项研究表明，不饱和脂肪酸的摄入与女性的焦虑水平呈负相关。此外，omega-3不饱和脂肪酸被证明可以缓解焦虑症患者的焦虑症状，这些结果与本研究中的行为实验一致。
柏子仁提取物中高水平的不饱和脂肪酸可能通过影响脂质代谢产生抗焦虑作用。多种脂质可以通过复杂的代谢过程与其他成分相互作用，在心血管疾病和神经系统疾病等各种疾病的发展中发挥重要作用。神经元细胞膜富含各种磷脂，包括磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。不饱和脂肪酸是重要的成分，对维持神经元细胞膜的稳定性至关重要。血清代谢组学的结果显示，与正常小鼠相比，具有焦虑样行为的动物中不饱和脂肪酸如PC（20:5（5Z，8Z，11Z，14Z，17Z）/16:0）、PC（20:3（8Z，11 Z，14 Z）/18:3（9Z，12 Z，15 Z））、LysoPC（18:3（9Z、12 Z、15 Z）/0:0）和PG（18:0/20:4（5Z、8 Z、11 Z、14 Z））显著上调。
与模型组相比，口服氟西汀、BZR和OBZR可显著下调这些磷脂（p < 0.05）。然而，之前的一项研究表明，焦虑症的症状与血浆磷脂水平呈负相关，这与我们的研究结果不同。据推测，外周循环中磷脂含量的增加导致中枢神经系统中不饱和脂肪酸的缺乏，从而导致神经元结构不稳定，并最终引发焦虑样行为。口服富含不饱和脂肪酸的柏子仁提取物，补充了不饱和脂肪酸类物质的不足，具有抗焦虑作用。这一结果表明，柏子仁的脂肪酸样成分是其抗焦虑活性成分之一，这一结论也得到了网络药理学和分子对接结果的支持。FABP是脂质代谢、能量稳态和炎症的中枢调节因子，介导长链脂肪酸的摄取、运输、储存和信号传导。从细胞质向细胞核选择性递送特定脂肪酸会激活PPARD等核受体，影响脂质代谢。花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）是一种产生炎症介质白三烯和脂毒素的起始酶，影响身体的炎症反应，并与一定比例的精神疾病有关。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是调节脂质代谢基因表达的关键转录因子。PPARA表达水平的增加可减少脂质沉积。PPARD激活神经酰胺合成，这与我们代谢组学研究结果中改变的LacCer（d18:1/12:0）含量数据一致。研究结果表明，补充不饱和脂肪酸可以影响脂质代谢，从而通过炎症、神经源性和其他途径缓解焦虑。然而，柏子仁提取物是一种复杂的混合物，仍需进一步研究以确定哪些成分具有抗焦虑作用。
网络药理学中的信号通路富集分析表明，“神经活性配体-受体相互作用”通路与柏子仁提取物的抗焦虑作用密切相关。包括血清素（5-羟色胺）、多巴胺、γ-氨基丁酸（GABA）、类固醇激素和内源性大麻素在内的神经活性配体已显示出对焦虑症的改善作用。血清素在中枢神经系统（CNS）中起着重要作用，研究者在焦虑症患者和有焦虑样行为的动物中都发现了中枢神经系统中血清素的减少，尤其是在焦虑相关的大脑区域，如海马体、杏仁核、额叶皮层和背侧中缝核，血清素含量明显减少。药物处理后，成人和儿童患者的血清素水平随着焦虑症的缓解而回升。在实验动物的大脑中使用血清素受体拮抗剂等物质也可以直接诱导类似焦虑的行为，这进一步说明了血清素在焦虑症中的关键作用。一些与多巴胺和焦虑症相关的研究表明，多巴胺分泌减少或阻断多巴胺受体D1和D2会增加焦虑样行为，而其他研究表明，在中脑中，多巴胺的释放会增加焦虑水平。这种矛盾的原因取决于多巴胺释放的位置及其激活受体的功能。类固醇激素包括皮质酮、雌激素和其他类似的激素物质。皮质酮在焦虑症中起着重要作用，长期给药会诱发小鼠的焦虑样行为。同样，具有焦虑样行为的小鼠出现血浆皮质酮水平和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴失调。雌激素参与了体内的各种生物过程，雌激素的减少可能与焦虑和抑郁的发展有关。在更年期妇女中，雌激素水平开始下降，同时焦虑的发生率增加，而经期妇女的焦虑水平也与雌激素分泌减少有关。在动物实验中，雌性小鼠在切除卵巢后表现出更高水平的焦虑。内源性大麻素在突触后去极化和/或受体激活时从突触后神经元释放。释放的内源性大麻素随后激活突触前终末CB1受体（CB1R），从而调节焦虑样行为。
我们发现，这两种不同的提取物在抗焦虑作用方面产生了一些变化，这可能与NAD的代谢有关，NAD是人体氧化还原反应中的一种重要氢受体。它调节参与多种分解代谢途径的脱氢酶活性，包括糖酵解、谷氨酰胺分解代谢和脂肪酸氧化。在真核生物中，在这些反应中被接受的电子随后被提供给电子传输链以形成ATP。体内NAD水平通常相对稳定，在特定条件下的显著消耗可能代表一种异常状态，与DNA损伤、衰老和神经退行性病变有关，在轴突损伤后的轴突变性中发挥关键作用。焦虑的发作可能与神经系统损伤有关。NAD的代谢产物N1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺在OBZR组中显著下调，但在氟西汀和BZR组中没有变化。这表明，OBZR组小鼠的NAD代谢减少，神经损伤减少，导致OBZR小组小鼠的焦虑样行为减少。
结论
本研究通过GC-MS在OBZR中鉴定出11种脂肪酸甲酯和1种烯烃，并通过LC-MS在柏子仁50%甲醇提取物中鉴定出14种化合物，主要是脂肪油。行为实验结果表明，BZR和OBZR均具有抗焦虑作用。非靶向代谢组学与网络药理学和分子对接相结合表明，柏子仁通过影响脂质代谢和神经活性配体-受体相互作用，改善了CUMS小鼠的焦虑样行为。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37201666/
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