抑郁症是一种常见的精神疾病，以显著而持久的情绪低落为主要临床特征，主要表现有心境低落、意志活动减退、思维迟缓和认知功能损害，同时伴有睡眠障碍、焦虑，甚者出现严重的自残或自杀行为[1]。抑郁症的病因和发病机制复杂，且尚未完全阐明。目前认为中枢神经炎症是抑郁症发病的核心机制之一，机体长期暴露于高水平的炎性细胞因子可诱发神经系统的病变，进而可能导致抑郁障碍等神经精神疾病的发生[2]，表现为炎症因子能促进活性氧自由基生成，直接损伤与抑郁症发病相关的脑区神经元和胶质细胞，扰乱神经内分泌功能，引起抑郁症相关的各种症状[3-4]。临床研究发现，抑郁症患者外周血中的白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等细胞因子水平显著升高，使用抗抑郁药治疗后，上述促炎细胞因子的水平显著降低[5]。活化的神经小胶质细胞会产生大量炎症介质，诱导神经炎症和认知障碍[6]，其机制涉及炎症反应发生密切相关的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性小体激活，NLRP3炎性小体存在于中枢神经系统的小胶质细胞和星形胶质细胞中[7]，激活后释放炎症因子并启动下游炎症反应[8]，诱发的神经炎症参与神经损伤，可导致疾病和抑郁样行为。
荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.挥发油及其主要成分胡薄荷酮、薄荷酮具有良好的抗炎作用，能够减轻炎性损伤[9]。左旋薄荷酮还能抑制下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA）轴过度活化，促进皮质脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达，从而发挥抗抑郁作用[10]。课题组前期研究表明，荆芥挥发油的良好抗炎效应与抑制NLRP3炎症小体激活有关[11]，同时发现荆芥挥发油通过减轻神经炎症反应对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的抑郁样模型小鼠发挥保护作用[12]。基于前期研究基础，结合目前中药挥发油的中枢神经系统作用的认识[13]，本研究采用慢性温和不可预知应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）诱导的小鼠抑郁样模型，开展荆芥挥发油的抗抑郁作用及NLRP3/细胞焦亡通路作用机制研究，为进一步探究荆芥挥发油的抗抑郁作用及临床应用拓展提供实验依据。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性ICR小鼠，5周龄，体质量18～20 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2019-0010。所有动物均自由饮食饮水，在24 h明暗周期的环境中饲养，昼夜各12 h，温度（25±1）℃，相对湿度40%～60%。本实验符合动物实验伦理学标准，获得成都中医药大学实验动物伦理委员会的批准（批准号20200320）。
1.2 药材
荆芥穗S. tenuifolia Briq.购自太极大药房，批号20210101，经成都中医药大学鉴定教研室严铸云教授鉴定符合《中国药典》2020年版要求。
1.3药品与试剂
盐酸氟西汀（fluoxetine，FLX）胶囊（20 mg/粒，批号9833A）购自Patheon France公司；小鼠IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒（批号分别为E-EL-M0037C、E-EL-M3063）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号P0010）购自碧云天试剂公司；UltraSignal超敏ECL化学发光底物（批号4AW011-100）购自北京四正柏生物科技有限公司；二甲苯、中性树胶（批号分别为10023418、10004160）购自国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸（批号G10000218）购自武汉谷歌生物科技有限公司；NLRP3兔多克隆抗体（批号T55655ES）购自Abmart公司；凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）兔多克隆抗体（批号DF6304）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）兔多克隆抗体（批号AF5418）、cleaved Caspase-1兔多克隆抗体（批号AF4022）、IL-1β兔多克隆抗体（批号AF4006）、gasdermin-D（GSDMD）兔多克隆抗体（批号AF4012）、离子钙结合适配器分子-1（ionized calcium binding adapter molecule-1，Iba-1）兔多克隆抗体（批号DF6442）均购自Affinity公司；β-tubulin兔多克隆抗体（批号GB11017B）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗体（批号GB11002）、尼氏染液（批号G1032）均购自塞维尔有限公司。
1.4 仪器
UPK-10T型纯水仪（广州市优普科技有限公司）；BS323S型电子天平（德国Sartorius公司）；3001型酶标仪、ST16R型冷冻离心机、Revos型脱水机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-6C型电泳仪电源（北京市六一仪器厂）；1658000型小型垂直电泳槽、转膜槽、ChemiDoc型免染型化学发光凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；JB-P5型包埋机、JB-L5型冻台（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；KD-P型组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；GFL-230型烤箱（天津市莱玻瑞仪器设备有限公司）；ECLIPSE E100型正置光学显微镜、DS-U3型成像系统（日本尼康公司）。
2方法
2.1 荆芥挥发油的制备
荆芥穗打粉，以6倍量水浸泡30 min后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，大火煮沸后微火加热至无挥发油生成为止，收集挥发油提取器中上层挥发油，无水硫酸钠脱水后避光保存，1 kg生药经提取得到9 mL荆芥挥发油。荆芥挥发油经GC-MS检测，其主要成分有胡薄荷酮、异薄荷酮、薄荷酮及胡椒酮等，相对质量分数分别为36.76%、14.39%、14.39%、2.73%[12]。
2.2 CUMS模型的建立、分组及给药
小鼠适应性饲养3 d后，按体质量分层随机分为对照组和造模组，对照组小鼠合笼饲养不施加造模程序，造模组小鼠单笼饲养，并施加CUMS程序进行造模：冷水游泳（4 ℃、5 min），空笼，夹尾（3 min），频闪灯刺激（12 h），明暗颠倒，禁食24 h，禁水24 h，潮湿垫料（12 h），异味刺激（3 h），束缚（3 h），鼠笼倾斜，噪音环境（60 Hz，1 h），将以上刺激因子随机分配，每日安排2种单因子刺激或复合因子刺激，相邻2 d刺激因子不重复，使动物不能预料刺激的发生。给药期间造模程序不停止。造模前及开始造模后每周测定小鼠糖水偏好率，连续造模6周后，与对照组比较模型组小鼠糖水偏好率出现显著降低，提示造模成功。随后依据小鼠糖水偏好率，将造模组小鼠重新分组，使各组糖水偏好率相近且与对照组比较均有显著性差异，分为模型组、FLX（10 mg/kg，相当于成人临床日用剂量的30倍）组和荆芥挥发油高、低剂量（100、50 mg/kg，分别为1/5 LD50、1/10 LD50）组，每组10只，其中荆芥挥发油的剂量设置参考其急性毒性实验结果及以往研究基础[12]。各给药组ig相应药物（20 mL/kg），对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续给药5周。
2.3 行为学实验
2.3.1 糖水偏好实验 糖水偏好实验前，各组小鼠给予1瓶白水与1瓶1%蔗糖水饮用，适应一边白水、一边蔗糖水的情况。适应12 h后，所有小鼠单笼饲养，禁食禁水12 h。每只小鼠各给予1瓶白水与1瓶1%蔗糖水，称定2只水瓶质量。在小鼠饮用白水或蔗糖水12 h后，取下水瓶，再次称定水瓶质量，以2次水瓶质量差值记为小鼠白水或蔗糖水的消耗量，计算小鼠糖水偏好率。造模前测定小鼠糖水偏好率基础值，造模开始后于每周固定时间测定小鼠糖水偏好率1次。
糖水偏好率＝蔗糖水消耗量/(白水消耗量＋蔗糖水消耗量
2.3.2 强迫游泳、悬尾实验 参考文献方法[14-15]，各组小鼠于处理前1周进行实验。
（1）强迫游泳实验：在高30 cm、直径20 cm的圆柱型透明器皿中注入20 cm深清水，温度（25±2）℃。将小鼠置于器皿内，计时6 min，前2 min使其适应性游泳，记录后4 min内累积不动时间。
（2）悬尾实验：将小鼠尾部后2 cm处用胶带固定在水平位置，使其呈倒挂状态，头部离下水平面5～6 cm，记录动物在6 min内后4 min的累积不动时间。
2.3.3飞溅实验 将10%的蔗糖水连续3次喷于小鼠背部靠近尾端处。之后放入小鼠原本居住的笼中记录5 min内小鼠的梳洗时间（小鼠梳洗背部喷洒糖水位置的行为时间记为梳洗时间），于取材前1周进行测定。
2.4 ELISA检测血清炎症因子水平
行为学测试完毕后，小鼠眼球取血，室温静置2 h，3500 r/min离心10 min（离心半径7.5 cm），分离血清，按试剂盒说明书测定血清中IL-1β及TNF-α水平。
2.5 尼氏染色检测海马CA3区尼氏小体
取小鼠大脑组织固定于4%多聚甲醛中，常规方法脱水、透明、浸蜡并包埋。取小鼠全脑蜡块切片（3 μm），烘干后将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min，水洗。甲苯胺蓝染色45 min，水洗，0.1%冰醋酸分化，水洗终止反应，显微镜下控制分化程度，水洗后置于60 ℃烤箱烘干。切片于二甲苯透明5 min，中性树胶封片。置于显微镜下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，IDO法检测海马CA3区尼氏小体平均吸光度（A）值。
2.6免疫荧光法检测小鼠海马CA3区NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β和Iba-1的表达
取各组小鼠脑组织脱水、包埋、切片（约3 μm），切片常规脱蜡至水，用柠檬酸缓冲液进行抗原修复。PBS溶液（pH 7.4）洗涤后用组化笔画圈，在圈内加入自发荧光淬灭剂后流水冲洗。牛血清白蛋白封闭30 min后，滴加PBS配制的一抗，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50 min。切片于荧光显微镜下观察并采集图像，使用CaseViewer 4.0扫描浏览软件选取组织的目的区域对海马CA3区进行成像，应用Image J软件分析平均荧光强度。
2.7 Western blotting检测海马组织NLRP3/细胞焦亡通路相关蛋白表达
称取各组小鼠海马组织20 mg，加入RIPA裂解液200 μL匀浆、裂解，12 000×g离心10 min后，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度，调整蛋白浓度一致后，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，洗膜后分别加入NLRP3、ASC、GSDMD、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、Iba-1（1∶1000）兔抗，4 ℃孵育过夜；洗膜后孵育二抗（1∶5000），洗膜后在凝胶成像系统中成像，Image Lab凝胶图像分析系统分析条带灰度值。
2.8 统计学分析
采用SPSS 26.0软件进行实验数据统计，以表示，计量数据符合正态性分布的采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或t检验，不符合正态者则采用非参数检验法分析。
3 结果
3.1 荆芥挥发油对CUMS模型小鼠行为学的影响
3.1.1 糖水偏好率 如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠糖水偏好率显著降低（P＜0.05），提示动物快感缺失，出现抑郁样行为，表明造模成功。
与模型组比较，各给药组小鼠糖水偏好率显著升高（P＜0.01），表明荆芥挥发油能够改善模型小鼠快感缺失的行为异常表现，表现出抗抑郁作用。
3.1.2 强迫游泳、悬尾实验不动时间及飞溅实验梳洗时间 如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠游泳及悬尾实验中的不动时间分别延长（P＜0.05），飞溅实验中小鼠梳洗时间缩短（P＜0.01），表明CUMS模型小鼠出现行为学异常。与模型组比较，各给药组小鼠悬尾和强迫游泳实验中的不动时间明显缩短（P＜0.01、0.001），梳洗时间延长（P＜0.05）。
3.2 荆芥挥发油对CUMS模型小鼠血清炎症因子水平的影响
如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠血清IL-1β水平明显升高（P＜0.05），TNF-α呈升高趋势；与模型组比较，各给药组小鼠血清IL-1β水平显著降低（P＜0.05、0.01），TNF-α呈降低趋势。
3.3 荆芥挥发油对CUMS模型小鼠海马CA3区尼氏小体的影响
如图1所示，对照组小鼠海马神经元尼氏体丰富，着色明显，排列整齐，神经元细胞形态结构较好。与对照组比较，模型组小鼠海马CA3区神经元细胞排列不佳，细胞间间隙增宽，胞体多角形变小改变明显，海马神经元细胞皱缩，胞质尼氏体数量减少。与模型组比较，各给药组海马CA3区神经元形态结构正常，胞质尼氏体丰富呈蓝染颗粒状，染色比较清晰，排列较为整齐。如表4所示，与对照组比较，模型组尼氏小体数量明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组尼氏小体数量均显著增加（P＜0.05、0.01），说明荆芥挥发油可以通过发挥神经保护作用对抗动物的抑郁样行为。
3.4 荆芥挥发油对CUMS模型小鼠海马CA3区NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1表达的影响
如图2和表5所示，与对照组比较，模型组小鼠海马CA3区NLRP3、cleaved Caspase-1及Iba-1的荧光强度显著升高（P＜0.05、0.01），IL-1β有升高趋势，提示小胶质细胞的激活及炎症反应启动；与模型组比较，各给药组cleaved Caspase-1和Iba-1荧光强度显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），FLX组NLRP3荧光强度显著降低（P＜0.05），FLX组和荆芥挥发油高剂量组IL-1β荧光强度显著降低（P＜0.05）。
3.5 荆芥挥发油对CUMS模型小鼠海马组织NLRP3/细胞焦亡通路相关蛋白表达的影响
如图3和表6所示，与对照组比较，模型组小鼠海马组织NLRP3、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β、ASC、GSDMD、N-GSDMD和Iba-1蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05、0.01），提示CUMS模型小鼠海马组织中小胶质细胞活化且NLRP3炎症小体被激活，细胞焦亡发生，引起小鼠海马部位的神经炎症。与模型组比较，各给药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD、N-GSDMD、蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05、0.01、0.001），荆芥挥发油各剂量组cleaved Caspase-1、Iba-1蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01、0.001），FLX组和荆芥挥发油低剂量组pro IL-1β、ASC蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05、0.01），表明荆芥挥发油能对抗模型小鼠海马组织中小胶质细胞的活化，同时抑制NLRP3炎症小体的激活，抑制细胞焦亡，从而减少炎症因子释放。
4 讨论
传统中药挥发油（精油）依赖于其独特的芳香气味、易透过血脑屏障、多靶点、不良反应少等特点，通过抗焦虑、抗抑郁、镇静安神、神经保护等多种药理活性，在防治抑郁、焦虑等情志疾病上呈现出独特优势[13]。荆芥挥发油作为荆芥的主要物质基础，已被证明具有良好的抗炎、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛等作用[16]，且前期研究亦表明其抗炎作用与其对抗LPS所致的抑郁样模型小鼠行为学异常有关[12]，因此究其抗抑郁效应，值得进一步探究。
CUMS抑郁模型模仿了人类抑郁症的发生和发病机制，被认为是较为理想的动物抑郁模型[17-20]。接触重复应激的动物糖水消耗会减少，出现快感缺乏迹象，因此糖水偏好实验可用于评价抑郁程度[21-22]。飞溅实验主要观察动物是否出现行为淡漠状态。本实验结果表明，CUMS造模后，小鼠糖水偏好率降低，提示CUMS抑郁模型构建成功。荆芥挥发油连续给药5周，能明显提高糖水偏好率，显著缩短小鼠悬尾与强迫游泳实验中不动时间，延长飞溅实验中的梳洗时间，结合小鼠行为绝望抑郁模型的结果，表明荆芥挥发油具有抗抑郁作用。
近年来研究认为，压力增加会引起外周和中枢神经系统中的促炎细胞因子释放，以及大脑中小胶质细胞的激活，特征表现为细胞表面标志物Iba-1的增加。IL-1β和TNF-α作为炎症介质在细胞信号传导中发挥重要作用，自身也会影响神经递质系统、大脑功能和情绪[23]，与抑郁症的发生、发展较为密切[24]。本研究结果发现，CUMS模型小鼠血清中炎症因子IL-1β、TNF-α水平升高，小鼠海马CA3区Iba-1蛋白表达上调，提示小胶质细胞被激活，荆芥挥发油则能显著对抗上述变化，表明药物能抑制小胶质细胞激活，减少炎症因子释放，从而抑制神经炎症来发挥抗抑郁作用。当神经元长期受到应激或受损时，尼氏体会减少、解体甚至消失，常被用于评估神经元损伤表现[25]。与模型组小鼠比较，荆芥挥发油治疗后能减轻小鼠海马CA3区神经元形态病理表现，增加尼氏小体数目，提示药物对CUMS造模导致的海马神经元损伤有保护作用。
研究认为，抑郁症的神经炎症反应病理机制与小胶质细胞功能变化、Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）以及NLRPs等信号通路有关[26]，其中NLRP3炎症小体被证实参与了抑郁症的发病机制[27]。NLRP3作为炎症小体的核心蛋白，组装ASC和Caspase-1形成NLRP3炎症小体，NLRP3炎症小体被激活后，cleaved Caspase-1切割GSDMD中N端和C端结构域之间的接头，然后N端GSDMD结构域片段易位到质膜形成膜孔，导致细胞裂解死亡或通过孔分泌成熟状态的IL-1β、IL-18，诱导一系列炎症反应，最终引起细胞焦亡[28-29]。本研究结果发现，CUMS抑郁模型小鼠海马组织NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β蛋白表达水平显著上调，免疫荧光法同样表明NLRP3、IL-1β蛋白表达量增加，提示模型小鼠海马组织NLRP3炎症小体被激活，致使炎症因子增加；进一步检测发现GSDMD、N-GSDMD、cleaved Caspase-1表达量增加，提示出现细胞焦亡，进而导致神经元的损伤。研究结果也证实了抑郁症的发生与NLRP3炎症小体激活、细胞焦亡发生密切相关。荆芥挥发油治疗后，上述蛋白的表达量均呈现下调的表现，表明荆芥挥发油能通过抑制NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡发生，从而减轻神经损伤来发挥抗抑郁作用。
综上，本研究证实了荆芥挥发油的抗抑郁作用，并提示其抗抑郁作用与抑制NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡、抑制小胶质细胞活化、降低炎症因子表达等有关。研究结果丰富并拓展了荆芥挥发油良好抗炎作用的应用依据，明确了该挥发油的抗抑郁作用表现。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：秦甜甜，黄如杨，谢红潇，胡靖文，曾九僧，刘 蓉，曾 南．基于NLRP3/细胞焦亡通路研究荆芥挥发油的抗抑郁作用及作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(12):3878-3886.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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