英文原题：Genetically Encoded Aminocoumarin Lysine for Optical Control of Protein-Nucleotide Interactions in Zebrafish Embryos
供稿人：侯雨辰
大家好，今天为大家推荐一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，文章标题为“Genetically Encoded Aminocoumarin Lysine for Optical Control of Protein-Nucleotide Interactions in Zebrafish Embryos”。文章通讯作者是美国匹兹堡大学的Alexander Deiters教授。
在胚胎发育的早期阶段，各种信号通路相互协调并受到严格的时-空调控，从而实现细胞的正确分裂分化与各器官的形成。将光脱笼非天然氨基酸以遗传编码的方式定向插入激酶等的活性位点，即可通过施加光照对特定的信号通路实现精准调控，而这项技术对于研究胚胎早期发育中的信号通路及其串扰具有重大的意义。本文中，作者开发了一种可光脱笼的新型氨基香豆素赖氨酸，并将其应用于斑马鱼胚胎中蛋白激酶A(PKA)及一种NRAS致病突变体的精准光激活。
图 1. ACK及AC2K在哺乳动物细胞中的定点插入。
(A) HCK、HC2K、ACK和AC2K的化学结构；(B) HEK293T细胞中ACK及AC2K在报告基因中的定点插入；(C) NIH 3T3细胞中NLS-EGFP-AC2K的表达(活细胞样品)；(D) HeLa细胞中NLS-EGFP-ACK(上)和 NLS-EGFP-AC2K(下)的表达(固定样品)。
在先前的研究中，一系列以香豆素作为光保护基团的赖氨酸衍生物已被报道应用于细胞及斑马鱼胚胎内数种蛋白的激活，然而这些非天然氨基酸在中性或弱酸性亚细胞区室中的应用仍受到较大的限制。为解决这一问题，同时降低光毒性及提升脱笼效率，本文作者在先前已报道的7-羟基香豆素赖氨酸(HCK)基础上做了进一步的优化，设计并合成了两种7-氨基香豆素保护的赖氨酸衍生物ACK及AC2K。与HCK相比，7-氨基香豆素赖氨酸衍生物均表现出了更高的消光系数(ε)与分解量子产率(φ)，并在更宽的pH范围内(pH = 5-8)表现出了良好的光脱笼效率，最终脱笼效率约提升至HCK的3.4倍。此外，ACK的最大吸收波长发生红移(λ max = 348 nm)，相较先前报道的HCK(λ max = 330 nm)更适于在可见光波段进行脱笼激活，这一优化将有效降低光脱笼过程中潜在的光毒性。
作者首先在大肠杆菌及哺乳动物细胞内实现了两种7-氨基香豆素保护赖氨酸的定点插入。考虑到两者结构的高度相似性，本文作者推测已报道的HCK氨酰tRNA合成酶(HCKRS)同样可用于ACK及AC2K的定点插入，并成功验证了这一猜想。此外，作者也发现相较HCK，耐受pH范围更宽的ACK及AC2K在细胞中均表现出了更强的荧光。基于这一结果，作者指出ACK及AC2K有被用作蛋白质亚细胞定位荧光标记的巨大潜力：作为最小的蛋白荧光标记物之一，在定向插入并取代非关键残基时，单个非天然氨基酸的插入几乎不对蛋白功能及定位造成干扰，且在活细胞及固定标本中均适用。
图 2. 荧光素酶报告基因中ACK的定点插入。
(A) fLuc中ACK插入位点的结构示意图；(B) 哺乳动物细胞中ACK在双荧光素酶报告基因中的定点插入与激活；(C) 在斑马鱼胚胎中定点插入ACK的操作示意图；(D) 斑马鱼胚胎中中ACK在双荧光素酶报告基因中的定点插入与激活。
随后，本文作者通过双荧光素酶报告基因fLuc K529TAG-rLuc进一步验证了ACK在HEK293T细胞中受405 nm光照后的脱笼能力以及对蛋白活性的调控能力。在培养基中加入1 mM ACK时，转染报告基因的HEK293T细胞表现出高rLuc活性，但不具有fLuc活性，表明ACK有效插入并成功抑制了fLuc的催化功能。而在405 nm光照后，fLuc 活性发生显著提升，表明ACK成功脱保护并导致fLuc催化活性的恢复(图2，B)。此外，作者也在斑马鱼胚胎内通过双荧光素酶报告基因进行了验证(图2，C)。作者发现，在斑马鱼胚胎内定点插入ACK的fLuc在光照激活前不存在泄露活性，在405 nm光照下照射10秒便可观察到fLuc的有效激活，并在光照激活2 min后达到最大激活效率(图2，D)。
为了进一步验证ACK在蛋白激活中的巨大潜力，作者将ACK插入Cre重组酶K201TAG 中。这一实验在Cre重组酶报告基因转基因斑马鱼品系胚胎中完成，作者发现405 nm下照射2 min可有效激活Cre重组酶活性，并使6 hpf(受精后6 h)胚胎从表达EGFP转变为表达mCherry。对于未经照射的胚胎，则表达EGFP。
图 3. 蛋白激酶A (PKA)的光脱笼激活。
(A) 光激活前后PKA催化口袋内ACK或K残基与ATP的结构示意图；(B) PKA突变体caPKA不受上游GPCR和腺苷酸环化酶的影响；(C) 表达PKA-ACK的斑马鱼胚胎在4 hpf 光照激活并在24 hpf成像；(D) 斑马鱼胚胎轴向转录本的RT-qPCR分析结果。
蛋白激酶A (PKA)是第一个被成功解析结晶结构的激酶，其激酶口袋中的关键残基K72与ATP互作，进而实现对底物的催化磷酸化。尽管目前已有至少197种PKA底物被报道，然而研究者对PKA在发育过程中执行的具体功能却仍知之甚少。本文作者推测，在K72残基处定向引入ACK可能实现对PKA活性的有效光控。PKA通常需与cAMP结合，使抑制结构域与激酶结构域解离从而激活。本文作者使用了PKA的组成型活性突变体caPKA，使其在不需要cAMP的情况下也能表现出高活性。
作者发现，直接注射PKA mRNA将导致24 hpf胚胎出现明显的体轴缺陷。表达K72位定向插入ACK的PKA的斑马鱼胚胎通常具有正常的表型，但在4 hpf (原肠胚形成前)用 405 nm 光照射将导致大多数胚胎产生与过表达组成型激活的caPKA时相似的体轴缺陷。PKA的过度激活已被证明可在斑马鱼胚胎发育早期上调轴向转录本。作者对在4 hpf光照激活PKA K72ACK并在6 hpf收集的斑马鱼胚胎裂解液进行RT-qPCR分析，发现表达野生型和及受光照激活的PKA K72ACK的胚胎轴向转录本增加了2倍，而未经光照激活的PKA K72ACK胚胎则具有正常水平的转录本(图3，D)。此外，作者观察到，在10 hpf收集裂解液时，PKA K72ACK激活后对轴向转录本的影响已可忽略不计。这一结果表明，与连续产生活性caPKA的mRNA注射不同，对表达PKA K72ACK的胚胎照射激活会在短时间内迅速产生固定量的活性PKA，这些具有活性的蛋白会随着时间的推移而降解，因此这一策略将有效帮助研究者深入了解特定信号通路在特定发育阶段中的作用。
图 4. NRAS RASopathy致病突变体的光控激活。
(A) NRAS突变体激活前后催化口袋内核苷酸结合位点示意图；(B) RAS/MAPK信号通路示意图；(C) ACK 定点插入HA-NRAS G60E K16TAG (NRAS-ACK)；(D) NRAS-ACK 光激活后不同时间点下游ERK的磷酸化水平变化。
RAS是RAS/MAPK信号通路中的关键上游参与者，参与从胚胎发育到癌症相关的多种细胞过程。其中，致病突变NRAS G60E已被证明可以通过降低RAS与GAP的结合力导致细胞和斑马鱼胚胎中的RAS/MAPK信号通路发生持续激活。RASopathy相关的致病突变通常会导致在不同组织和胚胎发育的不同时间点发生各种各样的缺陷，但这些过程由于通路之间存在的复杂串扰，难以通过一般的实验手段进行直接研究。本文作者认为，向RASopathy相关致病突变体中插入ACK并进行时间分辨的光激活将有助于深入探究其致病机理。
NRAS的晶体结构表明，保守的关键残基K16可与来自GTP的β-和γ-磷酸基团上的两个氧形成氢键，对于GTP的结合和后续催化过程十分关键。因此，本文作者认为在NRAS G60E K16残基处定向引入ACK可能对NRAS的活性造成有效调控，并在斑马鱼胚胎中对这一设想进行成功验证(图4，D)。随后，作者在荧光RAS/MAPK信号报告基因斑马鱼品系胚胎中对NRAS G60E在不同发育阶段激活时的影响进行了深入研究。作者发现，表达NRAS G60E的胚胎均出现严重背部化畸形。对于表达在K16残基处定点引入ACK的NRAS G60E胚胎，在6或8 hpf光照激活的胚胎大多可正常发育，而3 hpf时光照激活则可导致类似于NRAS G60E胚胎出现的严重畸形，而ACK或在3 hpf的405 nm光照本身不会干扰其正常发育(图5，D)。根据这一结果，作者推测NRAS G60E突变体的致病过程需发生在斑马鱼胚胎原肠胚形成前(约5 hpf)。
图 5. RASopathy致病突变体的光控激活。
(A) EGFP在tg(dusp6:egfp)品系胚胎10 hpf时的预期分布，其中EGFP表达用于指示ERK分布；(B) EGFP荧光水平的量化结果(胚胎在6 hpf时接受光照，并在10 hpf时进行量化分析)；(C) 各实验组Tg(dusp6:egfp)胚胎的代表性图像；(D) 各组胚胎分别在指定的时间点接受光照，并在24 hpf时对背部化畸形水平进行分析。
心脏缺陷是RAS蛋白病(RASopathy)患者最为严重和致命的并发症之一。为进一步研究RAS致病突变体与心脏缺陷的关联，作者在心肌荧光转基因斑马鱼系Tg(myl7:egfp)中表达在K16残基处定向引入ACK的NRAS G60E突变体。结果表明，无论是表达NRAS G60E突变体还是在6或8 hpf光照激活的NRAS G60E突变体，在48 hpf均可观察到心脏缺陷的发生(图6，B、C)，且多数为循环缺陷。
图 6. RASopathy与心脏缺陷的引发。
(A) 斑马鱼胚胎中出现的心脏循环缺陷示意图；(B) 48 hpf各组胚胎心脏的表型分析；(C) Tg(myl7:egfp)品系各组胚胎心脏在48 hpf的代表性图像。胚胎可见心包水肿，则表示心脏功能受损。
综上，本文作者合成了可在405 nm光照下脱笼的7-氨基香豆素赖氨酸ACK及其衍生物AC2K，并在哺乳动物细胞及斑马鱼胚胎中成功定点插入。相较先前报导的7-羟基香豆素赖氨酸，7-氨基香豆素赖氨酸表现出更高的脱笼效率，并在弱酸性环境下表现出更优异的性能。随后，ACK被应用于通过调控两种三磷酸核苷与蛋白的互作来分别实现PKA与NRAS致病突变体G60E的时间分辨光照激活，成功揭示了斑马鱼胚胎不同发育阶段中特定信号通路被异常激活时所产生的不同影响，展示了定点插入光脱笼非天然氨基酸技术在酶活性调控与信号通路时间分辨研究中的巨大潜力。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
