英文原题：Epitope-Directed Antibody Elicitation by Genetically Encoded Chemical Cross-Linking Reactivity in the Antigen
通讯作者：王峰
作者：朱朝阳、徐良、陈龙欣、张孜涵、张雨菡、吴伟平、李呈祥、刘爽、向书芹、代盛旺、张捷、郭徽、周银建
背景介绍
抗体药物因具有高特异性，低不良反应的特征，已成为近年来开发的主要一类新药。抗体筛选是开发单克隆抗体药物、双特异抗体药物、ADC药物和CAR-T等细胞治疗药物的必经之路。筛选出优质的功能性抗体是药物开发的前提。
功能性抗体一般需要结合在抗原的特定表位上，比如阻断配体和受体的相互作用，或作为激动剂介导信号传导。然而，有效的作用表位仅占目标蛋白的很小的表面区域。现有方法利用全长蛋白作为抗原免疫动物，能够产生针对目标表位抗体的概率很低，需要通过后续大规模筛选获得功能抗体。更不利的是，一些非功能性的免疫优势表位会进一步增强目标抗体的筛选难度。
现有成熟的抗体筛选技术主要有：杂交瘤技术和噬菌体展示技术，以及近年来快速发展的单B细胞筛选技术。这些技术筛选高度依赖抗原和抗体的亲和力，获得的抗体严重偏向免疫优势（ immunodominant）表位；并且现有技术无法针对指定的目标表位进行定向筛选， 获得的抗体可能只结合而无功能。
文章亮点
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首次实现体内针对抗原目标空间表位的定向抗体应答。通过在抗原中定点插入化学交联活性的非天然氨基酸，利用体内B细胞克隆选择、进化，产生表位特异性的抗体应答，这种作用效果显著，产生的抗体大多数识别目标表位。
2
该方法普遍适用于各种蛋白和多肽抗原。表位靶向富集可用于高效筛选药物抗体，为领域内的困难靶点的功能性抗体筛选提供独特的技术；并且可以提高抗原免疫后的中和抗体效价，有望成为开发高效重组蛋白疫苗的新技术。
图文解读
1. 抗原和B细胞受体（BCR）的共价结合产生了具有显著优势的亲和力
体液免疫反应过程中，抗体的应答和成熟过程高度依赖抗原与BCR之间的亲和力。免疫优势的表位是这些表位能够与BCR产生更强的亲和力，并会产生更多数量的B细胞克隆，这些B细胞克隆产生的抗体会特异识别这些免疫优势表位。依据该原理，人工设计出的免疫优势表位可以实现针对该表位定向产生应答抗体。
将一种具有交联特性的非天然氨基酸编码插入到抗原的目标表位中，该交联特性的氨基酸可以与相结合的BCR相应亲核基团形成共价键结合，由于共价键的结合强度要远大于一般的抗体与抗原之间的非共价相互作用，使得该表位成为超优势表位。
2. 插入化学交联的非天然氨基酸实现抗原表位定向应答
以hIL-1β为研究对象，IL-1β是关键的促炎症细胞因子，其作用机制是结合其受体（IL1RI和IL1RII）介导下游信号。阻断IL-1β和IL1RI的结合可治疗一系列的炎症相关的疾病，代表药物是诺华制药的Canakinumab。通过hIL-1β-Canakinumab Fab复合体的结构发现E64号氨基酸残基是IL-1β结合关键位置，我们选取该氨基酸残基作为修饰位点，利用密码子扩展体系构建一系列非天然氨基酸定点修饰的抗原。研究发现，带有化学交联活性非天然氨基酸的抗原（E64AcrK）免疫小鼠后，体内产生的抗体血清能够同时结合野生型的抗原和突变体抗原。通过特殊设计的包含高强度洗脱的噬菌体筛选方法，我们获得了一个能够和E64AcrK抗原发生化学交联反应的抗体CL-E2，该抗体能够与特异性的与E64AcrK形成共价键结合，证明通过化学交联的非天然氨基酸实现了抗体特定表位的应答，并且在抗原抗体的作用界面上进化出一个化学反应中心。
3. 特定修饰的抗原实现了表位定向抗体富集及功能性抗体产生
研究者进一步地测试了多种非天然氨基酸，并非所有的非天然氨基酸都能够实现抗体表位定向诱导应答的目的，而具有不同化学交联反应活性的非天然氨基酸产生的效果也有所差异。研究者优选了Kcr作为后续的研究对象，因其交联活性相对弱，能够在引起抗体表位定向应答的同时保留产生抗体的多样性。接下来，研究者选择了IL-1β和IL1RI作用的关键氨基酸残基Q15，构建了Q15Kcr突变体来免疫小鼠，证实其在体内产生了高水平的中和抗体效价，表明该技术路线有望应用于高效蛋白疫苗的开发。
总结与展望
自21世纪初报道了将非天然氨基酸定点引入蛋白质的基因密码子扩展系统，实现对生物领域的中心法则的底层拓展，已经在科研领域实现广泛的应用，比如在蛋白相互作用、定位成像、结构功能的研究。基因密码子扩展有望从蛋白质功能水平、细胞水平到生命体水平逐渐应用推广，最终实现基于非天然氨基酸体系的合成生物学目标。
本研究中开发的新技术创造性地将非天然氨基酸与抗体免疫工程结合，利用非天然氨基酸修饰的抗原实现了抗体表位定向应答及筛选的目标。突破了传统抗体筛选技术依赖亲和力而受制于免疫优势表位的长期瓶颈问题，为公认的困难靶点的治疗性抗体和蛋白疫苗开发提供了独特而有力的技术。
潜在应用方向
1. 表位需求明确的高选择性抗体筛选
比如C5a的抗体，开发特异性抗体不仅需要有效地阻断hC5a与hC5a受体(C5aR)的结合，而且还需要对hC5a与人C5 (hC5)具有高度的选择性，理想的表位是埋藏在hC5内部的位点。
2. 免疫弱势的目标表位
以GPCR靶点为例，GPCR是重要的药物靶点类别，但针对GPCR的抗体筛选困难。除了GPCR本身蛋白体外表达困难、GPCR蛋白胞外区较小之外，其核心功能区域在物种间非常保守，常规的免疫方式难以获得针对功能区域的抗体应答。
3. 翻译后修饰的抗体
蛋白翻译后修饰（PTM）是蛋白相互作用的一种调控方式，针对蛋白的特定PTM的抗体一直是行业的难点。一般用多肽修饰方式作为抗原，难以获得针对空间构象表位的抗体。可以结合本技术获得针对特定PTM诱导富集抗体应答。
4. 针对病毒的保守位点的中和抗体
开发抗病毒抗体除了追求高效的中和活性以外，由于病毒的快速传播和复制性，病毒在选择压力下发生变异而导致免疫逃逸。广谱中和抗体的优势在于针对高度保守的抗原表位，是近年来抗病毒抗体研发的热点之一，例如针对HIV，流感病毒和冠状病毒等。
通讯作者信息
王峰，中国科学院生物物理研究所，研究员，博士生导师。主要研究方向：利用合成生物学手段开发生物制药领域中的关键技术。曾在美国Calibr、Scripps和GNF长期从事生物医药研究工作。在美国Calibr担任首席研究员期间，负责创新药物的前期研发，部分新药产品已转让跨国药企，进入临床研究。他的团队获得了科技部重点研发计划（首席科学家）、国家自然科学基金、中科院先导专项等经费支持，在国际一流期刊发表研究论文60多篇，20多项成果申请全球专利。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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