Med | 武汉大学胡争团队构建新的CRISPR脱靶检测模型，能够快速建立脱靶预测

CRISPR基因组编辑在临床转化中具有巨大潜力。然而，非特异性作用一直是一个主要关注点。

2023年6月5日，武汉大学胡争团队在Med（IF=17）在线发表题为“Massively parallel CRISPR off-target detection enables rapid off-target prediction model building”的研究论文，该研究基于AID-seq，开发了一种混合策略，可以同时识别多个gRNA的靶向和非靶向效应，并利用混合的人类和人乳头瘤病毒（HPV）基因组来筛选416个HPV gRNA候选的最有效和安全的靶标，用于抗病毒治疗。

该研究还使用了2069个单导RNA（sgRNA）的混合策略，以大约500个为一组的规模来分析新发现的CRISPR工具FrCas9的特性。重要的是，该研究通过CRISPR-Net深度学习方法成功构建了一个非靶向检测模型，使用这些非靶向数据（接收者操作特征曲线下的面积[AUROC] = 0.97，精确率-召回率曲线下的面积[AUPRC] = 0.29）。总之，AID-seq是迄今为止最敏感和特异的体外脱靶检测方法，而AID-seq策略可以作为一个快速、高通量的平台来选择最佳的sgRNA并表征新CRISPR的特性。

CRISPR-Cas9正在成为医学研究、生物技术和农业等不同领域中不可或缺的工具，并对其进行了革命性改变。然而，CRISPR的非特异性作用仍然是一个重大关注点，尤其在治疗应用中。即使很少量的细胞发生非特异性作用也可能会导致克隆扩增，从而产生严重的副作用。因此，准确和全面地识别低频非特异性作用非常重要。非特异性作用检测方法可以分为三类：基于计算的预测、基于细胞的体内捕获编辑事件和使用纯化的基因组DNA识别切割位点的体外方法。

然而，每种方法都有其独特的优点和局限性。例如，基于计算的预测虽然非常方便，但可能无法识别大部分经过验证的非特异性作用。体内非特异性作用检测方法GUIDE-seq具有较低的假阳性率，但仍可能错过大量真阳性的非特异性作用。而SITE-seq和CHANGE-seq等体外非特异性作用检测方法可以检测到大部分真阳性的非特异性作用，即使频率较低，但由于背景噪音的影响，可能存在假阳性的非特异性作用。

因此，必须开发新的体外非特异性作用检测方法，以提高低频非特异性作用的检测率，同时最小化背景噪音和降低假阳性率。目前，鉴定CRISPR非特异性作用的常规流程是使用体外方法识别所有低频非特异性作用，然后通过靶向测序在细胞模型、动物模型和临床应用中对其进行验证。此外，已发表的非特异性作用检测技术只能以低通量的方式分析非特异性作用。如何同时检测数百个gRNA的非特异性作用，并生成可用的大规模gRNA资源以快速构建非特异性作用预测模型，仍然是一个挑战。

为了解决这些问题，该研究开发了一种新的体外非特异性作用检测方法，名为适配子介导的测序非特异性作用识别（AID-seq）。该技术的特点是使用两种不同的适配子，即发夹式i7适配子和生物素i5适配子。前者用于消除由自由的双链DNA断裂产生的背景噪音，以降低假阳性率，而后者则用于选择性富集CRISPR诱导的双链DNA断裂，以提高灵敏度。重要的是，作者基于AID-seq开发了一种高通量的混合非特异性作用检测策略，可以在同一管中同时准确表征数百个gRNA的靶向活性和非特异性作用效应。此外，基于混合AID-seq生成的大规模非特异性作用数据，作者为新发现的CRISPR-FrCas9构建了一个准确的非特异性作用预测模型。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.medj.2023.05.005

转自：“iNature”微信公众号

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