NBT | 中国科学院王皓毅/张勇/项光海开发新型TnpB微型基因编辑工具

作为Cas12核酸酶的进化祖先，转座子(IS200/IS605)编码的TnpB蛋白起着紧凑的RNA引导DNA内切酶的作用。

2023年6月29日，中国科学院动物研究所王皓毅、张勇及项光海共同通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为“Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors”的研究论文，该研究为了探索它们的进化多样性和作为基因组编辑器的潜力，从64个注释的IS605成员中筛选出了25个在大肠杆菌中活跃的TnpBs，其中3个在人类细胞中活跃。

该研究进一步表征这25个TnpBs可以直接从基因组序列中预测转座子相关基序(TAM)和右端元件RNA (reRNA)。该研究建立了一个在原核生物基因组中注释TnpB系统的框架，并应用它鉴定了另外14个候选系统。其中，ISAam1(369个氨基酸(aa))和ISYmu1(382个氨基酸)TnpBs在人类细胞的数十个基因组位点上显示出强大的编辑活性。研究结果显示这两种RNA引导的基因组编辑器显示出与SaCas9 (1053 aa)相似的编辑效率，但其体积要小得多。TnpBs的巨大多样性为发现其他有价值的基因组编辑器提供了潜力。

最后，Nature Biotechnology 同时发表了Research Briefing文章对该研究成果进行了总结和展望（High-throughput screening of TnpB proteins identifies hypercompact genome editors）。

CRISPR-Cas系统，如Cas9和Cas12，已经发展成为强大的基因组编辑工具。除了产生DNA双链断裂外，失活(dCas)或缺口酶(nCas)版本已被设计成可重新编程的DNA结合或缺口系统。不同的域被融合到dCas或nCas中，建立了表观基因组编辑、碱基编辑和初始编辑技术。然而，由于Cas9和Cas12a的大尺寸(> 1200个氨基酸(aa))，它们的治疗应用受到阻碍，因为广泛使用的载货大小有限(~4.7千碱基(kb))，腺相关病毒(AAV)颗粒递送它们具有挑战性。其他结构域的融合进一步增加了整体尺寸，并使基于AAV的交付更具挑战性。因此，人们已经进行了大量的工作来鉴定或优化紧凑的Cas9同源物(~1,000 aa)，如Nme2Cas9和SaCas9。最近的研究进一步表明，微型Cas12f同源物(400-700 aa)，包括Un1Cas12f1、SpCas12f1和AsCas12f1，在人类细胞中是活跃的，尽管经过大量优化后，总体中位数编辑频率低于10%

通过增加进化深度，鉴定出了Cas效应蛋白的小祖先蛋白(~ 400aa)。IscB和TnpB由同一个转座子家族编码，即插入序列200/605 (IS200/IS605)，分别代表Cas9和Cas12的祖先分支。IscB(以OgeuIscB为例)和TnpB (ISDra2)都能靶向人细胞中的内源性基因座，具有显著的编辑效率(0.1-2%，OgeuIscB的中位数为0.2%;1-20%， ISDra2中位数为5%)，以RNA引导的方式。Cas12f仅以低丰度存在于少数原核生物门中，而IS200/IS605是最古老的转座子家族之一，广泛存在于原核生物中。IS200/IS605家族主要由另外三个类群组成:仅含TnpA转座酶的IS200类群、同时含TnpA和TnpB的IS605类群和仅含TnpB的IS1341类群。此外，TnpB也可以被IS607家族编码。因此，TnpB构成了原核生物中最大的基因群，有超过一百万个假定的位点。加上小尺寸，TnpB代表了一个未被开发的微型基因组编辑器的巨大来源。

TnpB系统的演化与功能特性（图源自Nature Biotechnology ）

为了鉴定具有高活性的TnpB系统，该研究通过两轮筛选和鉴定探索了IS605 TnpB系统的进化多样性。该研究首先筛选了64个公开注释的IS605成员，并通过证明可以从基因组序列中提取TAM和rRNA支架来支持TnpB作为归巢内切酶的功能。该研究开发了一个框架来从头注释并从原核生物基因组中选择潜在的活性TnpB系统，然后进行实验测试。

该研究共筛选了78个TnpB系统，鉴定出33个活性系统，其中5个在人类细胞中具有活性。特别是，大小仅为369 aa和382 aa的ISAam1和ISYmu1 TnpBs，优于先前发表的三种Cas12f编辑器(例如Un1Cas12f1)，并且在编辑效率方面表现出与SaCas9相似的性能，并优化了Nme2Cas9。此外，它们显示出与这些Cas编辑器相当的编辑专一性。通过使研究的计算和实验协议可用，预计这一发现框架将促进对TnpB的更深入挖掘和理解。

综上，该研究建立了适用于TnpB编辑器的大规模筛选体系，进一步证明了TnpB在转座子扩张中的功能，并对这一类编辑器进行了系统的功能解析，从而获得了目前最小的具备原创知识产权的微型基因编辑器。考虑到体内基因治疗和细胞治疗经常因Cas蛋白过大而递送受限，这一成果将推动相关方面的研究和临床应用。

该研究由中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院完成。北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所王皓毅研究员、项光海博士和中国科学动物研究所张勇研究员为文章的共同通讯作者。项光海博士、研究生李源清、孙晶、霍雍元为文章的共同第一作者。王皓毅研究员长期致力于新型基因编辑工具的开发（Cell Discovery 2019）及CAR-T细胞治疗研究（Cancer Cell 2022）；张勇研究员则致力于转座子等机制介导的新重复基因的起源和进化研究（Nature Ecology & Evolution 2022、Nature Communications 2021）。两个团队的合作推动了对TnpB的挖掘。该研究得到了科技部、中国科学院先导专项、农业农村部和国家自然科学基金委等项目的资助。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01857-x

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01858-w

转自：“iNature”微信公众号

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