20世纪80年代以来，中国肥胖的成年人数量增加了4倍多，成年人超重/肥胖率已超过50%，在儿童青少年中也已达到20%，并呈流行趋势，肥胖已成为中国乃至全球的重大公共卫生问题［1］。肥胖是引发心脑血管疾病、高血压、糖尿病和脂肪肝等慢性疾病的主要危险因素之一，预防和控制肥胖是全社会共识［2-3］。
肥胖的主要特征是脂肪组织的过度膨胀和积累。受遗传和不良生活方式的影响，前脂肪细胞可过度分化，脂肪细胞数量增加，体积增大，导致代谢异常，从而增加心脑血管疾病、脂肪肝和糖尿病等慢性病的发病率［4］。前脂肪细胞向脂肪细胞的分化与肥胖发病密切相关，这一过程受多种蛋白调控，包括调控脂代谢的转录因子、脂肪细胞特异性基因和脂肪生成酶等。其中，CCAAT增强子结合蛋白家族（C/EBP-α、-β和-δ）和过氧化物酶体增殖物激活受体家族（PPAR-α、-β和-γ）在脂肪分化和脂肪形成过程中起关键作用［5-6］。在脂肪分化早期，C/EBP-β和C/EBP-δ被诱导，随后反式激活PPARγ和C/EBP-α的表达［7］。PPARγ被认为是脂肪形成的主要调节因子，PPARγ的表达和活性是脂肪形成所必需的，C/EBP-α主要在脂肪分化末期诱导一些脂肪细胞特异性基因的激活［8］。此外，固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）是脂肪形成的重要转录调节因子，可通过调节脂肪合成基因如乙酰辅酶A羧化酶1（ACACA）、脂肪酸合酶（FASN）和硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）的表达，调控脂肪酸和三酰甘油的合成［9］。因此，通过调控C/EBPs、PPARs和SREBP-1等转录因子的表达，抑制脂肪细胞的分化，减少脂肪生成，被认为是预防和改善肥胖的有效途径。
3T3-L1前脂肪细胞是体外研究脂肪分化和脂质代谢常用的细胞系，通过含胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的MDI培养基诱导，可以实现向脂肪样细胞的分化［10］。
胡黄连是传统常用中药，具有清虚热、退湿热的功效。药理研究表明，胡黄连具有保肝利胆、抗炎、调脂和调节免疫等多种作用［11］，其中环烯醚萜类被认为是其主要有效成分，研究最多的是胡黄连苷I、II［12-14］。但针对胡黄连有效成分改善脂肪分化，抑制脂肪合成方面的研究还未见报道。本研究利用3T3-L1细胞脂肪分化模型，研究了胡黄连苷I、II对脂肪合成和分化的影响，并探讨其可能的作用机制。
1 材料
1.1 细胞
小鼠3T3-L1脂肪前体细胞，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
1.2 主要药品与试剂
胡黄连苷I、胡黄连苷II均为实验室制备，质量分数＞98%；IBMX购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；门冬胰岛素购自诺和诺德（中国）制药有限公司；DMEM培养基、0.25%胰酶、青霉素-链霉素双抗、RNA Extraction Reagen（Trizol）均购自北京中科迈晨公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO）购自德国AppliChem公司；地塞米松、细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；油红O和四甲基偶氮唑盐（MTT）购自北京索莱宝科技有限公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；GAPDH一抗、辣根酶标记山羊抗兔和山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PPARγ、C/EBPβ、FAS一抗购自美国Santa Cruz公司；SCD-1购自美国Cell Signaling Technology公司。
1.3 主要仪器
伯乐电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Quantstudio 5实时荧光定量PCR（美国ABI公司）；observer D1倒置显微镜（德国ZEISS公司）；5810R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；酶标仪（美国Promega公司）；MCO-18AIC CO2培养箱（日本SANYO公司）；HFsafe-1800LC生物安全柜（上海力申公司）；Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；WB20恒温水浴锅（瑞士SalvisLab公司）；Diagenode SA超声波破碎仪（比利时Bioruptor公司）。
2 方法
2.1 MTT法检测胡黄连苷I、II对3T3-L1细胞活力的影响
取对数生长期的3T3-L1细胞，以每孔5×103的密度接种于96孔板内，过夜培养，弃去旧培养基，每孔加入含胡黄连苷I、II 0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol·L-1的DMEM培养基100 μL，对照组不加药，继续培养48 h，另设不接种细胞的空白组。每孔加入20 μL质量浓度为5 mg·mL-1的MTT，放入培养箱继续孵育4 h，弃去上清液，加入DMSO，每孔150 μL，于摇床上振摇10 min，至甲臜沉淀充分溶解后用多功能酶标仪检测在570 nm处的吸光度（A）值，计算细胞相对存活率。
细胞相对存活率＝（A给药－A空白）/（A对照－A空白）
2.2 3T3-L1细胞的培养、诱导分化及给药
3T3-L1细胞正常培养使用含10%胎牛血清和100 U·mL-1青霉素-链霉素的DMEM培养基。诱导分化时，将细胞以每皿2×105个的密度接种于6 cm细胞培养皿中，每48小时更换1次培养基直至细胞完全融合，更换为MDI分化DMEM培养基（0.5 mmol·L-1 IBMX＋1 μmol·L-1地塞米松＋10 μg·mL-1胰岛素），培养分化48 h，然后用含有10 µg·mL-1胰岛素的维持培养基培养，每48小时更换1次，观察细胞分化状态，在诱导分化的同时全程给药，分为对照组和胡黄连苷I、II（20、40 μmol·L-1）组。3T3-L1细胞诱导分化实验过程的示意图见图1。
2.3 油红O染色
经过诱导给药处理后的3T3-L1细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，用4%多聚甲醛固定30 min，超纯水洗去多余固定液，60%异丙醇润洗1次，然后加入60%油红O工作液，染色20 min，双蒸水清洗5次至没有多余油红O残留。显微镜观察染色情况并拍照。为了定量脂质堆积，各组加入等量的100%异丙醇，将油红O溶出，测量560 nm处A值，以模型组A值为100%，计算各组脂肪蓄积率。
2.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测相关基因转录水平
用Trizol试剂提取3T3-L1细胞总RNA，测定RNA的浓度，经逆转录合成cDNA。随后进行qRT-PCR，用20 μL的聚合酶链式反应体系：10 μL 2×SYBR，1 μL正向引物和反向引物，1 μL cDNA模板，8 μL ddH2O，扩增40个循环，根据PCR扩增所得各组的目的基因和内参基因的Ct值，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。小鼠基因引物序列见表1。
2.5 Western blotting检测蛋白表达
经过诱导给药处理后的3T3-L1细胞加入RIPA（强）细胞裂解液，超声破碎3 s×2次，在冰上静置，继续裂解30 min，每10分钟涡旋混匀1次，然后12 000 r·min-1、4 ℃离心20 min，取上清液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，统一各组样品浓度，加入蛋白上样缓冲液，95 ℃变性10 min制成蛋白样品。用8%～12%的SDS-PAGE电泳分离，使用半干转法转移到PVDF膜上，然后在5%的脱脂奶粉中封闭1 h，在4 ℃下与要检测蛋白的一抗孵育过夜，用TBST清洗膜3次，共30 min，与HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST清洗，滴加ECL化学发光液曝光，用Image J软件分析各蛋白条带灰度值。
2.6 统计学分析
数据以±s表示，使用GraphPad Prism 8.0.1软件处理，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Unpaired-t检验。
3 结果
3.1 胡黄连苷I、II对3T3-L1细胞活力的影响
如图2所示，与对照组比较，不同浓度的胡黄连苷I、II处理3T3-L1细胞24 h，均未对细胞活力造成显著影响。处理48 h时，胡黄连苷I仅在200 μmol·L-1浓度显著降低了3T3-L1细胞的活力（P＜0.01）；胡黄连苷II从50 μmol·L-1浓度开始表现出了对细胞活力显著的抑制作用（P＜0.01）。结果表明，浓度低于50 μmol·L-1的胡黄连苷I、II处理不会影响细胞的存活率，因此，采用20、40 μmol·L-1作为给药的低、高浓度进行后续实验研究。
3.2 胡黄连苷I、II对3T3-L1细胞脂质蓄积的影响
脂质蓄积是3T3-L1细胞脂肪分化的重要指标［15］。如图3所示，未经诱导分化和给药处理的对照组没有被油红O着色，表明没有向脂肪细胞分化，诱导后的模型组细胞形态不再是纤维形，表现为成熟脂肪细胞的圆形，油红O染色明显，表明细胞中有大量的脂肪蓄积。定量结果显示，与对照组比较，模型组脂肪蓄积率显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，不同浓度的胡黄连苷I、II均显著减少了3T3-L1细胞脂肪分化过程中脂肪蓄积率（P＜0.01），且胡黄连苷II表现出比胡黄连苷I更强的作用。这些结果表明，胡黄连苷I、II具有很好的抗成脂作用。
3.3 胡黄连苷I、II对成脂基因mRNA表达的影响
如图4所示，与对照组比较，分化诱导后的模型组与脂肪生成相关的基因ACACA、SCD1、FASN和FABP4的mRNA表达均显著增加（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，胡黄连苷I、II均显著降低了ACACA、SCD1、FASN和FABP4 mRNA的表达（P＜0.05、0.01），并且胡黄连苷I的不同浓度组之间表现出了明显的剂量相关性。
3.4 胡黄连苷I、II对脂肪合成相关转录调节因子mRNA表达的影响
如图5所示，与对照组比较，模型组的脂肪合成相关转录因子PPARγ和SREBP1的mRNA表达显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，胡黄连苷I、II处理组的PPARγ的mRNA表达均显著降低（P＜0.01），且表现出较好的剂量相关性；而对于SREBP1，胡黄连苷I、II的抑制作用仅在40 μmol·L-1时具有统计学意义（P＜0.05、0.01）。
3.5 胡黄连苷I、II对3T3-L1细胞分化及脂肪生成相关蛋白表达的影响
如图6、7所示，与对照组比较，模型组PPARγ、C/EBPβ和SCD1蛋白的表达显著增加（P＜0.01），表明经诱导培养后，3T3-L1细胞向成熟脂肪细胞分化；与模型组比较，胡黄连苷I、II各浓度均显著降低了SCD1蛋白的表达（P＜0.01），胡黄连苷I 40 μmol·L-1和胡黄连苷II 20、40 μmol·L-1组PPARγ、C/EBPβ蛋白的表达显著降低（P＜0.05、0.01）。
4 讨论
随着健康生活理念的普及，越来越多的人开始关注肥胖问题对健康和生活质量的影响。对于肥胖的防治，首选是生活方式干预策略，通过控制饮食、体育锻炼和行为认知的改变达到减重的目的。但当生活方式干预效果不佳，特别是已存在胰岛素抵抗、血脂异常等危险因素时，适当的药物治疗是必要的。目前，可用于肥胖治疗的非处方药物只有奥利司他，作用机制为减少胃肠道对膳食脂肪的吸收，而对于脂肪的生成和脂代谢没有明显影响［16］。
过度的前脂肪细胞分化和过量脂肪生成造成的脂肪细胞膨胀与肥胖的发展密切相关，因此通过抑制前脂肪细胞分化，调节脂肪生成是治疗肥胖的潜在途径。本研究的MTT实验结果显示，50 μmol·L-1以下的胡黄连苷I、II对正常生长状态的3T3-L1细胞活力没有显著影响，表明正常给药浓度的胡黄连苷I、II不会影响3T3-L1细胞的生长和增殖，且没有明显的细胞毒性。通过建立3T3-L1细胞脂肪分化模型，研究了胡黄连苷I、II对细胞分化和脂肪生成的影响。油红O染色结果表明，胡黄连苷I、II可显著减少3T3-L1细胞的脂肪生成和蓄积，且表现出显著的剂量相关性。
细胞的脂肪合成受到一系列造脂酶的调控，如FASN、ACACA、SCD1和FABP4等［17-18］。FASN可催化长链饱和脂肪酸的从头生物合成，ACACA催化乙酰辅酶A羧化成丙二酰辅酶A，是从头合成脂肪酸的第一步和限速步骤［19］，SCD1催化饱和脂肪酸产生单不饱和脂肪酸，在脂质生物合成中起重要作用，FABP4是脂肪细胞中的脂质转运蛋白［20］。多项研究表明，胡黄连提取物及有效成分可以降低血脂，改善与肥胖相关的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和炎症等［12，21］。Dhami-Shah等［22］的研究发现，胡黄连苷II可抑制脂肪酸转运蛋白5（FATP5）、SREBP1和SCD1的表达，减少游离脂肪酸（FFAs）摄取和脂肪生成，从而抑制FFAs诱导的HepG2细胞的脂肪蓄积。本研究中的qRT-PCR结果显示，胡黄连苷I、II显著抑制了ACACA、FASN、SCD1和FABP4 mRNA的表达，表明胡黄连苷I、II通过抑制多个造脂酶的表达，从而抑制了脂肪的生成，并且胡黄连苷I表现出了较好的剂量相关性。胡黄连苷II对造脂酶ACCAC、FABP4 mRNA表达的抑制作用未表现出剂量相关性，可能是因为胡黄连苷II在20 μmol·L-1时已表现出较强的抑制作用，因此低、高浓度组的药效相差较小，未能呈现出显著的剂量相关性，另外，50 μmol·L-1的胡黄连苷II已表现出对3T3-L1细胞活力的抑制作用，长时间给药时可能存在一定的细胞毒性。
PPARγ在各种脂肪组织中高度表达，是脂肪细胞发育和脂肪形成的主要调节因子，大多数已知的调节脂肪形成的转录抑制因子和激活因子都是通过调节PPARγ的表达或活性来发挥作用［23］。SREBP-1是脂肪合成的重要转录调节因子，主要调控ACACA、FASN、和SCD1等成脂基因的转录。有研究表明，SREBP1还通过诱导内源性PPARγ的表达来促进成脂分化［24］。本研究检测了胡黄连苷I、II对PPARγ和SREBP1 mRNA表达的影响，发现胡黄连苷I、II均显著抑制PPARγ mRNA的表达，高剂量组的SREBP1也有显著降低，Western blotting结果显示，胡黄连苷I、II显著下调了PPARγ蛋白的表达，表明胡黄连苷I、II通过抑制PPARγ的转录和表达，降低SREBP1的转录，调控3T3-L1细胞的脂肪分化和成脂基因的表达。
前脂肪细胞分化过程受多种转录因子组成的转录级联调控，其中C/EBPβ起着重要作用［17］。处于接触抑制状态的3T3-L1细胞，受到激素的刺激后，C/EBPβ蛋白表达会立刻显著增加，同时会重新进入细胞周期，开始DNA复制和细胞增殖，这一过程被称为有丝分裂克隆扩张（MCE），是细胞脂肪分化所必需的，在MCE后，C/EBPβ才具有DNA结合活性，诱导细胞PPARγ和C/EBPα的表达，随后表达产生脂肪细胞表型的基因，分化进入终末期。而当敲除或抑制C/EBPβ时，细胞则不会经历MCE，也不会再向脂肪细胞分化［25-26］。本研究中，胡黄连苷I、II显著降低了C/EBPβ的蛋白表达，且胡黄连苷I表现出了较好的剂量相关性，表明胡黄连苷I、II可能通过抑制C/EBPβ表达阻止了3T3-L1细胞的脂肪分化。
本研究结果表明，胡黄连苷I、II均可以抑制3T3-L1细胞的脂肪生成，减少脂肪蓄积，胡黄连苷I表现出了较好的剂量相关性，胡黄连苷II在低剂量时作用显著，但没有表现出较好的剂量相关性。其作用机制可能是通过抑制C/EBPβ的蛋白表达，阻止3T3-L1细胞进入MCE，下调了PPARγ的转录表达，最终抑制了ACACA、FASN等造脂酶的转录，从而抑制了细胞的脂肪分化，减少脂肪生成和蓄积。但对于胡黄连苷I、II如何调控C/EBPβ的表达，对细胞周期的影响以及对C/EBPβ下游其他成脂转录因子的影响还需进一步研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：常华杰，勾文峰，郭江红，许飞飞，侯文彬，李祎亮．胡黄连苷I、II通过调节C/EBP-PPARγ通路抑制3T3-L1脂肪前体细胞的分化和脂肪合成 [J]. 药物评价研究, 2023, 46(6): 1193-1200.
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