一项研究的背景不是由病理特征决定的，是由表型决定的，医学科研的目的揭示疾病的内在机理，挖掘对应的诊疗策略。表型就是疾病背后的某种病理或生理特征。疾病是医学问题，表型是科研问题。一个疾病可以囊括多个表型。基础科学要适用模块化思维。
医学科研就是用分子发生的变化或者分子间的调控来解释疾病发生发展的病理生理过程。
由疾入型的学习方法有两种，一种是读综述，第二种是看国家自然基金已经支持的项目题目。
模型可以理解为表型标签的注释，即把抽象的表型具体化，变成细胞、动物和组织标本的选择问题。模型实质上是基于伦理学用于替代人体进行研究。模型的选择一般是细胞加动物，in vitro & in vivo 。此外还有活体取材的ex vivo。
实验模型由大到小，由动物到细胞，与人体相似性越来越小，但是模型的稳定性和实验的可重复性却越来越高。经费问题也是非常值得关注的。
新手做科研商业化细胞株相比原代细胞要好很多。建立细胞系非常耗时间。研究较多的领域即使用到原代细胞，分离方法也很成熟。而罕见病大多数情况需要自己摸索条件，新手不友好。医生做科研要避免跟没有细胞模型的疾病死磕。
大多数文章的逻辑都是细胞，动物，组织标本。此外还有生信来源的模型数据。分子机制、细胞功能、动物实验、组织标本、生信数据就是一篇医学SCI的基本套路。
细胞与动物模型都可分为自发与诱导。越是高分的文章，往往动物模型越是复杂。例如基因敲除的小鼠，原代细胞诱导的PDX模型。
确定模型后就要精读文献，掌握套路。硕博论文是在学习模型的时候很有帮助。平常读文献的时候也要注意积累methods和一些常用句，这样写文章的时候可以大大减轻工作量。
基础科研五恒量：检测方法和分子标记
实验技能不是医生做科研的核心技能，管理科研项目才是。最重要的是科研思维，其次是写作能力，实验能力放在最后。
需要掌握的三点：一是研究某个疾病每个表型，需要用什么方法来评价。二是某个实验的原理及流程。三是这个实验的预期结果是什么，以及结果的表现形式。柱状图或者折线图，必须学会原始数据的分析方法。
医生基础科研实验的四个常规体系：
一是组学实验。分别是基因组学。蛋白组学，转录组学和代谢组学。组学实验有个好基友生物信息学。我们可以使用生物信息学的方法对其他高通量的筛选结果直接借鉴。
二是分子实验。PCR和Western blot 是几乎所有医学实验必备的项目。而分子实验的重点是基因的操作。围绕基因操作需要学习克隆、质粒、病毒载体、载体构建以及RNA干扰等。常规基因操作都可以商业化进行，饭设计到分子相互作用的，如免疫共沉淀等需要自己琢磨，这是分子实验中最难的部分，也直接决定文章的档次。
三是细胞实验。核心是培养能产出表型功能的细胞株。
四是动物实验。
关于分子标记物，典型的细胞模型是干细胞。所谓的分子标记其实是特异性表达的蛋白，大部分是膜蛋白，便于检测和分选。biomarkers大致分为两类:一类特异性代表表型特征。总是伴随表型出现。另一类跟通路有关。总是伴随机制出现。
DNA 、RNA和蛋白质这些生物大分子是医学研究的点睛之笔。哪怕两个项目疾病和表型一模一样，导致模型和实验方法的选择也大同小异，只要分子不一样，就是两篇不同的文章。
在基础科研里，老套路新分子是一种普遍的研究思路。
分子点睛有两个问题要重点探讨。一是怎么证明一个分子有某个方面的功能表型。答案是操作分子，人为地改变这个分子的表达(gain of function)，观察到表型；再把这个分子的表达降低，观察到表型消失(loss of function)。这就证明表型的出现与否与分子的上下表达有明显的相关性，进而可以得出结论。
有效的基因操作工具：PCR、测序技术的发展、RNAi。在细胞中过表达(over expression)一个分子的手段有两种，一是质粒，二是病毒。
质粒是一种环状DNA分子，通过特定的结构元件，将一段编码DNA转录后表达。质粒不能直接通过细胞膜，所以需要转染（脂质体、电穿孔、磷酸钙）。转染transfection、转导transduction、转化transformation。三个概念需要注意区分。病毒适用于原代细胞、神经细胞等难以进行转染的细胞，原理是类似的。
loss of function是一种反向操作，在医学研究里更为常见。因为在医学研究里我们关注的分子往往是致病因素，是随着疾病的发生而高表达的。使用loss of function可以模拟治疗，观察疾病相关的治疗是否减轻。
RNAi技术使得原本很繁琐的loss of function变得简单。原理如下：合成一段21个碱基的siRNA，就能对目标基因实现70%以上的表达沉默（knockdown)。knockout代表技术，CRISPR.
第二个重点问题，分子有多重类型。目前以DNA为研究对象的热点是表观遗传学。而以RNA为研究对象的爆款是非编码RNA。理解非编码RNA首先要了解micro RNA,其概念于2001年正式确立，但最早的发现要追溯至1993年。其后科学家累计发现了数以千计的micro RNA，都是长度大约22nt的内源性RNA分子，由茎环结构的前提加工而成，可以负向调控基因的表达(大约三分之一)，可以一对多，一对多，多对一。
还要了解长链非编码RNA，是一段200nt以上的长链RNA,近十年被大量鉴定出来，基本上蛋白质能够执行的调控形式，lncRNA都能参与。circRNA是lncRNA的一个分类，由于具有环状结构，不易被RNA酶分解，表达更加稳定。
从miRNA再扩展到circRNA是前人总结的一条高效的套路。
药物是三个产量里最具医学特色的变量。由于精准医疗的里面趋于实践，药物也要满足个性化诊断的需求，需要用分子靶点把潜在获益人群和非获益人群区分开，对机制有更深的理解。
药物作为变量的优点：药物的研究终点就是诊断和治疗的靶点，没有眼花缭乱的分子类型，也不需要进行转导。由于药物不是内源性分子，所以只能做gain of function,工作量一下子减半。
以药物为研究对象的总共有两个问题四种类型：
药物为什么有效:发现新药
老药新用
药物为什么无效:耐药机制
耐药逆转
第一个问题，药物为什么有效。发现药物可以从以下三种途径着手：第一种，寻找化合物可以申请科研院所现成的化合物库或者自己读文献寻找潜在有效的化合物。第二种，老药新用。来源于临床中细致的观察，看到一些病人特殊情况再结合其用药史，有蛛丝马迹再通过实验验证。也可以通过文献查找线索。
第三种，在中药中挖掘。但是做分子水平的研究还是单味药的有效部位或者有效成分比较可行。
药物加五要素，检测表型变化是最简单的套路。为了文章更加圆满可以增加作用靶点的探讨，也就是在有效的基础上再加上机制的探讨，即变量之间的组合。分子加通路，药物加分子，药物加通路。更进一步是三者的组合。
药物加分子如何玩转：在药物有效的前提下，加药以后影响的mRNA、蛋白有很多，通过高通量的手段总能找到一个有效的靶点。医学科研都是先锁定药，把表型做扎实，有了骨架再通过分子靶点提高文章的学术水平。
在药物有创新的前提下。选择靶点不要盲目追新，像激酶、膜蛋白、转录因子这一类用来解释机制就刚刚好。药物创新性不足时可以用靶点的创新来补充。寻找的靶点最好跟已知的表型关联有文献报道，否则还要通过过表达加沉默来进行验证。药物加通路是更简单的思路。
想要增加文章内容和数据丰富度，还可以设计平行表型，一个药物介导多个表型。而做成嵌套表型，逻辑上有加分，例如凋亡可以嵌套自噬，增殖可以嵌套细胞周期改变。
第二个问题，药物为什么原来有效，后来无效了？这种情况针对临床上已经广泛使用的药物，靶点也清楚，需要我们找到耐药机制，或者联合其他药物逆转耐药。药物无效研究的本质是分子和通路的改变，毕竟发现新药不易，而耐药逆转和药物敏感人群分子筛选的课题离转化很近，一旦突破可以使患者大大受益。涉及耐药的药物都是常见疾病的常见药物，套路模型都比较成熟。并且其是一个天生的表型嵌套逻辑结构，是一个比较实用的套路。
药物耐药的原因主要有以下几个：一是药进不去，转运通道出现问题。二是在体内继发灭活，如细胞内出现一些特殊的蛋白，或者靶点的结构发生改变，或者药物代谢方面出现改变。
耐药机制有继发性耐药和原发性耐药两种，近些年研究热点转移到原发性耐药上，这样可以有效区分获益人群，提高临床试验的效率。而对于原发性耐药，细胞株上加药诱导耐药模型往往不太适用，需要从临床样本的验证做起，确认分子的表达改变和药效是否存在相关性，统计分析之后再在细胞模型、动物模型上重现这些分子改变，最终得出结论。
DNA和RNA水平筛选分子的方法都是测序和芯片。在高通量筛选里的测序，一般特指NGS。蛋白和代谢组学水平筛选分子常用方法是质谱。
基因芯片检测的基本原理是杂交。通过一个已知序列的探针，与样品分子进行杂交，通过荧光信号来检测报告。人类基因组计划完成后，通过已知序列的探针就可以一次性检查大量分子的表达数据。
蛋白相互识别的原理是抗原抗体识别，分析通路时蛋白芯片常见些。一代测序，Sanger测序，费用便宜，一次约800个碱基。二代测序，荧光染料，计算机信号分析，为了提高效率可以建库，加上接头多线程操作。RNA也是先反转录为cDNA测序。三代分子测序，不需要 PCR扩增，单分子测序速度非常快，但价格昂贵。蛋白筛选是永恒的经典。经典方法是二维电泳，电泳跑出来以后，需要用质谱进行分析。在各种实验中都需要用质谱进行蛋白身份识别。
生信能力直接决定了浓缩提炼数据的效率与质量。面对一份高通量的筛选数据，处理结果有两个阶段：从测序或者芯片的原始数据转化成差异基因序列，谁服务谁负责。第二步，整合分析，包括交互作用网络分析分析可，功能聚类分析和相关通路分析。
来源：小药师学习笔记
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