2020 年，科学家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因开发了用于基因组编辑的 CRISPR 技术而摘得诺贝尔化学奖的桂冠。目前，基于 CRISPR-Cas9 基因编辑的多项临床实验也已启动并获得突破性结果，为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径。
CRISPR-Cas 系统就像宿主的免疫系统，它可以捕获 DNA 片段并将其整合到自己的基因组中，以增强对病原的防御能力。它就像一个特工，可以识别哪些 DNA 是「朋友」，哪些 DNA 是「敌人」，从而维持基因组的完整性，避免错误地攻击自己。CRISPR-Cas 系统中的 Cas1:Cas2 整合酶在这个过程中扮演着重要角色，但它们自己还不足以完成整个任务。
有趣的是，微生物中的 Cas4 内切酶成了这个任务的帮手。然而，并不是所有的 CRISPR 系统都有 Cas4 内切酶。有些 CRISPR 系统使用一种内外兼修的外切酶来选择和加工 DNA，并与 Cas1:Cas2 合作，一起完成 DNA 的捕获、修整和整合的工作。在这个过程中，外切酶整合酶会对 DNA 进行不对称的加工，在整合之前和之中生成特定大小的 DNA 碎片，并带有 PAM 序列，这个序列就像一个标记，告诉系统这是自己的 DNA，以防止 CRISPR 系统错误地攻击宿主自己的基因组。
这些发现支持了一个理论模型，即缺乏 Cas4 内切酶的 CRISPR 系统会使用与之合作或被吸纳的外切酶来获取新的 CRISPR 免疫序列，就像它们在寻找宿主的 DNA 朋友一样。这为作者理解 CRISPR 系统的运作方式提供了新的视角。
2023年 6 月 15 日，诺奖得主 Jennifer A. Doudna 在顶级学术期刊 Nature 杂志上以 Genome expansion by a CRISPR trimmer-integrase 为题发表了相关研究。
这项研究详细描述了 CRISPR 适应性免疫机制的高效工作方式。研究人员模拟重组了 Cas1:Cas2-DEDDh 复合物，发现外切酶在前间隔处理和整合的第一步中保留了 PAM，并由 DEDDh 活性位点去除。这与已知的 Cas4 不同，表明宿主外切酶在 PAM 处理中具有不同功能。整合酶调节外切酶活性，协调 PAM 处理和整合 DNA。
来源：Nature
主要结果
Cas1:Cas2-DEDDh 介导 CRISPR 的整合作用
作者探究了 Cas2-DEDDh 在 CRISPR 前间隔处理中的功能。作者制备和纯化了 Cas1 蛋白和 Cas2-DEDDh 蛋白，并在体外评估了它们对 DNA 底物的处理能力。
根据 Megasphaera CRISPR 阵列中 spacer 的长度和 I-E 型大肠杆菌 Cas1:Cas2 整合酶对底物的优先选择，推测首选的整合底物可能是一个含有 23 个碱基的双链 DNA，其中 5 个碱基在 3' 末端形成了一个单链突出部分。
为了评估这些酶的处理活性，他们使用了带有不同长度延伸单链 3' 末端突出部分的 5' 荧光标记前间隔底物进行 Cas1 和 Cas2-DEDDh 的修剪活性测定。结果只有 Cas1:Cas2-DEDDh 复合物能够产生与宿主 CRISPR 阵列中 spacer 长度相等的底物。整合酶需要一个含有 23 个碱基的双链 DNA 才能实现功能性处理。DEDDh 活性位点在处理活性中起关键作用，突变体复合物无法有效处理前间隔。这些结果表明完整的 Cas1:Cas2-DEDDh 复合物在前间隔处理中起到必要的作用，DEDDh 活性位点具有核酸降解活性。
图 1：Cas1:Cas2-DEDDh 将前间隔处理为正确的整合大小并保护 TT PAM。（来源：Nature）
实验结果显示，不同长度的前间隔底物处理效率相似。为了更好地了解前间隔处理的动力学，研究人员将荧光标记的前间隔与包含 CRISPR 的质粒进行了合并。结果表明，与具有延长突出部分的前间隔相比，经典底物的整合效率更高。
连接产物在 2 分钟后就产生，而具有延长突出部分的前间隔需要 10 分钟才能检测到连接产物。这结果显示，在连接到 CRISPR 之前，通过 DEDDh 的修剪，Cas1:Cas2-DEDDh 提供了一个分子标尺，使得前间隔适合整合。
Cas1:Cas2-DEDDh 修剪 PAM
为了研究 PAM 对前间隔处理的影响，研究人员改变了 PAM 区域。结果显示，Cas1:Cas2-DEDDh 在 5'-TT 位置识别 PAM。在没有 TT PAM 的情况下，DEDDh 将前间隔链修剪到适合整合的大小。然而，在正确的位置存在 TT PAM 时，DEDDh 导致有 PAM 的链的部分修剪，生成一个 33 nt 的产物。猜测这部分修剪是由于 Cas1 中 PAM 结合口袋的隔离所致，该口袋可以保护 PAM 和相邻的 3 个核苷酸免受核酸酶的作用。
为了揭示前间隔处理和 PAM 保护的结构基础，研究人员解析了 Cas1:Cas2-DEDDh 与含有和不含有 TT PAM 的前间隔底物的结构。Cas1:Cas2 保留了经典的异六聚体结构，包含两个 Cas1 二聚体和一个中央的 Cas2 二聚体桥接。一个 23 bp 的双链底物位于复合物的顶部，而 5 个核苷酸单链 3' 末端突出部分延伸到 Cas1 两个界面的裂隙中。
图 2：前间隔处理过程中的 Cas1:Cas2-DEDDh 的分子细节。（来源：Nature）
Cas1 和 Cas2-DEDDh 是一对内部测量器，用于确保每个 CRISPR 阵列中间隔的长度相等。通过双重的 Cas1 His29 残基，利用与 23 个碱基对的 DNA 双链末端 π 堆叠的方式测量长度，并固定前间隔链。
DEDDh 首先负责保护 PAM。冷冻电镜分析显示，DEDDh 活性位点与含有 PAM 的前间隔 DNA 分子发生相互作用。与 Cas1a' 的特定序列结合后，解释了 PAM 的识别机制。第一个 PAM 胸腺嘧啶位于 Cas1a' 的深层口袋中，与 Tyr126 和 Gly148 形成氢键。第二个 PAM 胸腺嘧啶与 Tyr171 发生 π 堆叠作用，使 T30 能够与 Tyr171 的骨架酰胺氮形成氢键。当没有 PAM 存在时，底物会被完全修剪，突出了序列特异性相互作用对对称修剪和 PAM 保护的重要性。此外，Cas1b' 的 C 端区域起到了封存被修剪核苷酸的作用。
DEDDh 切断前间隔的突出部分，PAM 结合口袋和 C 端夹阻止了进一步修剪，从而防止了对 PAM 和额外核苷酸的切割。尽管存在高浓度的非特异性外切酶，但修剪过程仍然是精确的。在 CRISPR 适应过程中，PAM 必须在下游被切割，这是保护机制的自然结果。
图 3：Cas1:Cas2-DEDDh PAM 的生化和结构分析。（来源：Nature）
在 DNA 半整合之后，DEDDh 会剪切 PAM。为了避免自身免疫，PAM 必须在插入 CRISPR 阵列之前被移除。在 DEDDh 催化失活条件下，整合产物链的缺失表明 DEDDh 活性位点扮演着处理 PAM 的角色，Cas1 与 CRISPR 阵列相互作用时会释放 PAM 供 DEDDh 修剪。研究揭示了 Cas1:Cas2-DEDDh 复合物对 PAM 的处理机制，同时定义了间隔的大小并阻止了 PAM 插入 CRISPR 阵列。
生化数据表明，DEDDh 结构域能够修剪 PAM，而 PAM 修剪活性是整合的必要条件。重复 DNA 与 Cas1a' 之间存在序列特异性相互作用。这些相互作用是由环 3 和螺旋 4 的连续二级结构决定的。
图 4：Cas1:Cas2-DEDDh 介导的体外全位点整合的重建。（来源：Nature）
Cas1:Cas2-DEDDh 复合物在整合过程中扮演了重要角色。整合事件发生在 DNA 重复序列的边界处，不仅仅是在特定位置附近。最初认为 Cas1:Cas2-DEDDh 复合物是用来识别和保护 PAM 序列的，但实际上它在整合之前会去除 PAM 序列。
混合实验发现没有 PAM 序列的样本整合的数量显著增加，表明整合酶在选择底物之前可能会检查是否存在 PAM 序列。整合酶对待处理的 DNA 结构表现出了类似的严谨性。
总结与展望
这项研究详细描述了 CRISPR 适应性免疫机制的高效工作方式，包括 Cas1:Cas2-DEDDh 复合物对 DNA 的处理和整合过程。研究发现，与已知的 Cas4 内切酶相比，这种修剪酶整合酶使用了一种新的 PAM 处理机制。此外，研究还揭示了 Cas1 通过对 DNA 进行保护，迅速暴露并去除 PAM 序列，以确保其正常工作。此外，DEDDh 酶在 DNA 的特定部位降解 PAM 序列，并在相邻的重复/间隔处发起反应。这项研究为作者了解 DNA 处理和选择过程提供了重要见解，并为进一步改进 CRISPR 技术中的 Cas1:Cas2 复合体提供了指导。
未来的实验应该利用这种有效的修剪整合酶来解决 CRISPR 适应性免疫机制中的未解之谜，并进一步发展全面的体外 CRISPR 适应性技术。
转自：“丁香学术”微信公众号
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