人类的遗传疾病主要由基因突变造成，并且约58%为单碱基突变（SNVs）。目前，不依赖DNA双链断裂和模板参与的单碱基编辑器（base editors）是治疗遗传病强有力的基因编辑工具。现有的碱基编辑技术CBE（C-to-T），CGBE（C-to-G），GBE（C-to-G/C-to-A）和ABE可实现胞嘧啶转换/颠换编辑以及腺嘌呤的转换突变，由于缺少切除肌苷的内源DNA糖苷酶，ABE的产物纯度可达99%。然而，仍有25%的人类单碱基突变遗传疾病需要精准的腺嘌呤颠换编辑（A-to-C或A-to-T）才能纠正，因此开发高效精准的腺嘌呤碱基编辑器具有重要意义（图1）。
图1：碱基编辑器介导碱基突变的种类及人类致病性点突变的分布
2023年6月15日，华东师范大学李大力课题组在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Adenine transversion editors enable precise, efficient A•T-to-C•G base editing in mammalian cells and embryos 的研究论文。
该研究报道开发了一系列腺嘌呤颠换编辑工具（AXBEs和ACBEs），并且证明了ACBEs在不同细胞系与小鼠胚胎中的高效性与精确性，其中产生的小鼠疾病模型（A>C平均效率44%-56%）等位基因突变高达100%。AXBEs和ACBEs为多元化的遗传操作和人类第二大类SNVs的基因治疗提供新的工具。
碱基转换可通过碱基脱氨实现，而碱基颠换则需要依赖无嘌呤无嘧啶（AP）位点的创建，随后进行碱基切除修复途径（BER）而完成。鉴于内源糖苷酶低效的肌苷切除修复能力，华东师大研究人员希望寻找其他可将肌苷作为催化底物的酶，在大多数原核和真核生物中，DNA中的次黄嘌呤是由烷基腺嘌呤DNA糖基化酶或者核酸内切酶V去除，因此研究人员尝试将9种体外具有潜在肌苷切除活性的酶与腺苷脱氨酶TadA-8e和nCas9融合，结果惊喜的发现小鼠来源的烷基腺苷DNA糖苷酶（mAAG）可实现8.7%的A到Y（Y=C或T）的碱基颠换，并且大鼠、枯草芽孢杆菌来源的融合构建体也可观察到一定的腺嘌呤颠换突变。进一步的位置关系测试发现mAAG位于构建体C端的编辑活性最高，因此将其命名为AXBE（X代表任意碱基）。
经过大量内源性靶点评价以及体外酶活实验发现AXBE具有YA*R（R=A或G）motif的偏好性。在含有YAR motif的靶点中，AXBE可产生15-32%的A到Y碱基颠换编辑。AXBE在HeLa细胞系中也可达到高达46%的腺嘌呤碱基颠换。通过Cas9依赖性/非依赖性脱靶评估以及RNA-seq脱靶检测发现，相比于ABE系统，AXBE的脱靶明显降低，尤其是在RNA水平上降低了90%。
为增加腺嘌呤颠换编辑效率并拓展靶向范围，基于结构导向的理性设计和筛选鉴定出mAAG中的两个关键突变（mAAG-EF）极大提高其底物肌苷的切除活性，基于此产生的AXBEv2介导更高效的A到Y编辑，甚至在非YAR-motif位点的颠换突变也显著提升，因此有效改善了颠换编辑的序列背景选择性。此外，mAAG-EF也可以兼容PAM识别更广的其他Cas9变体（如spNG，spRY），表明了更大范围的基因组靶向编辑。
虽然AXBEv2展现了高效的A>C/T编辑能力（C为主产物），但也诱导了严重的旁观者A to G突变，于是研究人员希望通过缩窄编辑窗口减少不想要的编辑副产物从而开发出ACBEs技术。腺嘌呤脱氨酶的改造及Cas9嵌入策略的尝试使得A到G的编辑副产物大幅降低，并且A到C的编辑效率还进一步提高，因此该类型编辑器被命名为ACBEs。ACBE版本最高可实现45%的A到C编辑以及73%的碱基颠换编辑，而ACBE-Q版本（TadA-8e中引入N108Q突变）相较于ACBE，进一步显著减少了旁观者A到G突变，更加精准地编辑sgRNA的A4-A6位，精确度最高提高了171倍，且产生背景水平的Cas9非依赖性脱靶事件（平均脱靶效率<0.3%），展现出较高的应用安全性。
近期 Nature Biotechnology 报道了杨辉/胥春龙团队合作开发的腺嘌呤颠换编辑器AYBEs（杨辉团队开发新型DNA碱基编辑器，首次实现高效腺嘌呤碱基颠换编辑），即在ABE8e基础上融合改造的人源N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（hAAG）。
在这项最新研究中，AXBEv2表现出与AYBEv3相似的腺嘌呤颠换活性同时伴随着旁观者A to G的突变，但相较于AXBEs和AYBEs，ACBE-Q却能在保持A到C编辑活性的前提下，产生更少的旁观者A to G编辑。
此外，ACBE-Q在小鼠体内也展现出极高的编辑效率和精度。在构建杜氏肌营养不良（DMD）小鼠疾病模型中，70%突变小鼠（21/30只）实现了靶位点A6 to C的编辑，平均编辑效率为56%，A to C编辑纯度最高可达到99.8%。
更重要的是, 传统的终止密码子产生只能依赖于胞嘧啶的突变，该研究证明了ACBEs可在富含AT的序列背景中基于腺嘌呤引入提前成熟的终止子，通过终止Tyr基因表达成功制备了小鼠白化病模型。最后研究人员评估了ACBEs编辑人类致病性SNVs位点的能力，结果表明ACBE在SH3TC2基因中有效产生63%的终止密码子，该基因的终止会导致腓骨肌萎缩症疾病，通过靶向MYO7A基因，ACBE精准产生与耳聋有关的L618R错义突变。
为了研究ACBEs的治疗潜力，研究者构建了携带STAT3 c.1145G>T（该热点突变引起复发性传染病）突变的稳转细胞系，ACBEs可以在目标位置引入了想要的A to C纠正编辑（图2）。
图2：ACBEs在小鼠体内精确编辑以及在细胞系中模拟或纠正人类致病SNVs
总的来说，该研究通过筛选发现小鼠来源的烷基腺苷DNA糖苷酶（mAAG）产生的腺嘌呤颠换编辑器AXBE可在特定序列中实现腺嘌呤的颠换，进一步的分子进化使得A>Y编辑最高可达73%。AXBEs带来丰富的密码子和氨基酸改变，未来将更适用于分子进化、遗传筛选、谱系示踪等应用。ACBEs能够在AT富集区域提前引入终止密码子扩大了基因调控的范围，并且mAAG与不同Cas变体的兼容性有望进一步扩大了A到C的靶向范围，表明了纠正人类第二大类致病性SNVs的治疗前景，另外ACBEs还可以作为独特的工具来探索与胸腺嘧啶相对的特定AP位点如何修复的机制。
华东师范大学生命科学学院博士毕业生陈亮、博士研究生洪梦佳和栾昌明为论文共同第一作者，华东师范大学为第一单位，华东师范大学李大力教授为论文通讯作者。麻省理工学院-哈佛大学博德研究所David Liu教授团队，华东师范大学/邦耀生物刘明耀教授、宋高洁教授、香港中文大学冯波教授等对该研究提供了重要支持。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-023-01821-9
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