英文原题：Direct Cytosolic Delivery of Proteins and CRISPR-Cas9 Genome Editing by Gemini Amphiphiles via Non-Endocytic Translocation Pathways
通讯作者：Zhijia Liu (刘志佳), Yuan Ping (平渊), Yongming Chen (陈永明)
作者：Zhicheng Le (乐志成), Qi Pan (潘齐), Zepeng He (贺泽芃), Hong Liu (刘鸿), Yi Shi (石毅), Lixin Liu (刘利新)
背景介绍
将外源性生物大分子例如蛋白质递送到细胞内，作用于细胞内靶点实现疾病治疗具有巨大潜力。然而，低细胞膜渗透性以及溶酶体降解等生物屏障限制了蛋白质胞内递送效率。递送载体作为克服蛋白质胞内递送屏障的有效工具能够直接穿透细胞膜，或通过内吞作用后经溶酶体逃逸机制将蛋白质释放到胞质内。然而，当前广泛研究的递送载体例如聚合物、多肽、或者无机纳米颗粒仍存在一定的局限性：首先，载体制备较复杂，或质控较差；其次，大部分载体适用于递送特定类型的蛋白质，限制了应用范围；再者，载体主要通过内吞作用进入细胞，其溶酶体逃逸效率低。因此，开发结构精确和可控的通用型递送载体实现高效胞内递送活性蛋白质将拓宽蛋白质治疗的应用前景。
文章亮点
1
利用Ugi多组分化学构建Gemini型两亲小分子库，筛选适用于蛋白质的胞内递送载体，揭示载体结构与性能关系；
2
Gemini型两亲分子主要通过膜融合方式直接递送蛋白质至细胞内，展示了优于商用试剂的递送效率；
3
Gemini型两亲分子可作为通用型蛋白质递送载体平台，实现胞内递送不同分子量和等电点的蛋白质，以及基因编辑复合物Cas9 RNP。
图文解读
Gemini型两亲分子由对称的疏水尾部和亲水/疏水连接基团连接的含可电离阳离子头部组成，通过筛选发现含有18–20碳原子的饱和疏水链尾部、合适的可电离阳离子头部以及亲水性连接基团构成的Gemini型两亲分子能够高效地递送多种分子量或等电点的蛋白质，以及基因编辑复合物Cas9 RNP到细胞内（图1）。在包含150种不同分子结构的 Gemini型两亲分子库中，发现有14种载体介导胞内递送效率高于商用试剂PULSin。作者通过内吞抑制剂、溶酶体共定位、溶酶体渗透性变化以及蛋白质信号追踪等方式证明Gemini型两亲分子主要通过脂阀介导的膜融合方式将蛋白质直接递送到细胞质内，避开内吞途径，提升胞内递送效率。
图1. 利用Ugi多组分反应合成Gemini型两亲分子并用于蛋白质胞内递送研究。（A）Gemini型两亲分子胞内递送各种分子量或等电点蛋白质以及Cas9 RNP示意图；（B）Gemini型两亲分子库设计及合成过程；（C）Gemini型两亲分子介导胞内递送蛋白质效率的体外筛选热图，采用商品化试剂PULSin作为阳性对照。
Gemini型两亲分子不仅能高效递送负电荷蛋白质，还可以将正电荷蛋白质递送到细胞内。除普通细胞系，Gemini型两亲分子还能将蛋白质递送到难转染的原代免疫细胞。递送到细胞质内的蛋白质仍保留很高的蛋白活性，例如递送到胞内的皂草素能够引起核糖体失活从而导致细胞死亡；递送到胞内的β-半乳糖酶能催化底物产生很强的深蓝色产物（图2）。
图2. Gemini型两亲分子递送不同分子量或等电点的蛋白质到不同种类细胞（A-C）；递送到细胞质内的蛋白质仍保留高蛋白活性（D-G）。
Cas9 RNP复合物是由sgRNA和Cas9内切酶组成的复合物，其结构复杂，分子量大，因此对递送载体提出更大的挑战。作者通过体外实验证明Gemini型两亲分子能够高效地递送Cas9 RNP并进行基因编辑，其效率显著高于商用试剂CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagent (CMAX)。进一步的体内动物实验证实Gemini型两亲分子递送Cas9 RNP可以有效破坏KRAS突变从而抑制肿瘤生长（图3）。
图3. 体外递送基因编辑Cas9 RNP（A-F）以及体内递送Cas9 RNP用于肿瘤治疗（G-L）。
总结与展望
本项工作定义了一种非传统类型的蛋白质递送载体，构筑了新型小分子递送载体设计平台，为实现蛋白质及基因编辑疗法提供强大的递送工具。
通讯作者信息
刘志佳 副教授，中山大学。重点围绕蛋白/核酸等生物大分子药物递送系统开展研究工作，发展了聚合物和脂质纳米递送载体材料，在胞内输送蛋白、抗体，或DNA和mRNA转染等方面表现出优异性能，可以满足不同生物制剂开发的应用需求。近五年在ACS Cent. Sci., Sci. China Chem., Adv. Healthcare Mater., Biomacromolecules, ACS Appl. Mater. Interfaces等期刊发表论文20余篇，申请和授权发明专利10余项。
平渊 教授，浙江大学。主要研究方向为药物递送技术在基因编辑治疗领域的应用，2017年底入职浙江大学后以通讯作者在Nat. Nanotechnol., PNAS, Sci. Adv., Adv. Mater.等杂志发表论文40余篇。曾获得JCR Emerging Leader Award、中国颗粒学会优秀报告奖、国际纳米药物大会青年学者论坛优秀报告奖、及浙江大学十大学术进展提名等。
陈永明 教授，中山大学。研究方向为大分子药物递送材料和应用技术、材料对免疫系统干预。主要成果包括：（1）采用生物材料递送蛋白/多肽抗原和分子佐剂，在手足口病、鼻咽癌及慢性乙肝等动物模型上效果显著；（2）开发全新结构的脂质体库，研发的LNP疫苗在特定组织和器官高效和安全表达；（3）建立纳米药物快速加工技术，解决了纳米制剂的高重现、规模化生产的技术瓶颈；（4）发展材料抑制游离核酸引起的炎症反应和肿瘤转移技术。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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