Cell Res | 何川/赵昌明等合作开发新的方法，用于绘制转录组范围内的2'-O-甲基化

2'-O-甲基化(Nm)是一种普遍存在于许多细胞RNA中的转录后RNA修饰，在调节真核RNA的物理性质和功能方面起着关键作用。长期以来，由于缺乏有效的定位方法，RNA中Nm修饰的研究一直受到阻碍。

2023年6月15日，芝加哥大学何川、Bryan C. Dickinson及武汉大学赵昌明共同通讯在Cell Research（IF=38）在线发表题为“Nm-Mut-seq: a base-resolution quantitative method for mapping transcriptome-wide 2′-O-methylation”的研究论文，该研究报道了一种碱基分辨率定量方法，Nm-Mut-seq，用于绘制转录组范围内的2'-O-甲基化。

为了开发在Nm位点具有诱变性的RT，作者采用了之前开发的基于荧光的RT选择平台(RT-PCR-IVT测定)，开发了变体RT- 41b4，除了具有RT-1306的诱变背景外，它还含有F61S和A62V替换。纯化后RT的体外生化表征进一步证实，RT- 41b4比RT-1306具有更高的荧光强度和更高的诱变效率。此外，RT- 41b4的稳态动力学分析和Sanger测序结果显示，在逆转录反应中，dATP，而不是dCTP和dGTP，是Nm位点错误结合的最佳核苷酸底物。此外，RT- 41b4在受限条件下的读取效率明显高于RT-1306，这表明进化后的RT在映射Nm修饰方面具有潜在的应用前景。

研究人员利用RT-41B4和优化的下一代测序(NGS)条件构建了Nm-Mut-seq，并验证了HeLa细胞核糖体RNA (rRNA)中的Nm修饰。作者分析了90个经几项研究证实的人类80S核糖体的带注释的Nm位点(Am、Cm和Gm) (Um位点未包括在列表中)，其中用该方法鉴定了83个。其他已知修饰类型，比如m6A、m7G, ac4C、m5C等等，显示变异率很低(< 5%)，这表明Nm-Mut-seq能够清晰地检测rRNA中的Nm位点。

使用Nm-Mut-seq进行转录组范围2'-O-甲基化的碱基分辨率定量定位（图源自Cell Research ）

为了确定Nm修饰的化学计量学，作者使用含有Nm-Mut-seq的合成寡核苷酸制备了Nm-Mut-seq文库，这些寡核苷酸的化学计量量不同。在含有100% Nm的探针上的结果显示，RT-41B4在不同序列背景下的Nm位点产生可变突变率，这表明序列背景相关突变率的校准可以促进更准确的修饰化学计量学估计。在含有0% Nm的探针上，结果显示未修饰寡核苷酸的突变率非常低。然后，作者获得了序列上下文相关的校准曲线，并将rRNA的突变频率转换为Nm化学计量。

结果，rRNA中69个Nm位点几乎被完全修饰(Nm分数> 80%)，其余部分被部分修饰。为了进一步研究Nm-Mut-seq是否可以监测遗传改变产生的Nm修饰水平的变化，作者对来自纤维蛋白(FBL)缺失的HepG2细胞的rRNA进行了Nm-Mut-seq。在FBL耗尽后，几个位点的Nm水平显著下降，这与Sharma等人和Erales等人先前报道的结果基本一致。随着RNA介导的敲低持续时间的增加，Nm分数呈持续下降趋势。

总之，Nm-Mut-seq不仅定量了rRNA中已知的Nm位点，还定量了人类mRNA中除Um位点外的数千个候选Nm位点。在这些mRNA Nm位点中，作者发现了数百个FBL依赖的Nm位点。该方法提供了一种在低丰度RNAs(如mRNA)中以碱基分辨率检测Nm的有效方法，并广泛测量每个修饰位点转录组的化学计量。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41422-023-00836-w

转自：“iNature”微信公众号

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