第一作者：王丽伟
通讯作者：余克服
通讯单位：广西大学
论文DOI：10.1016/j.bios.2023.115265
图文摘要
近日，广西大学王丽伟副教授课题组关于长棘海星快速示踪及暴发预警的研究成果，以“Ultrasensitive and on-site eDNA detection for the monitoring of crown-of-thorns starfish densities at the pre-outbreak stage using an electrochemical biosensor”为题发表在Biosensors and Bioelectronics上。
长棘海星(Crown-of-Thorns Starfish，Acanthaster cf. solaris，简称CoTS)被称为“珊瑚杀手”，是珊瑚的天敌。长棘海星具有超强的繁殖和存活能力，一旦大面积爆发，则会对健康的珊瑚礁生态系统造成生态灾害，比如澳大利亚大堡礁活珊瑚覆盖度在1985-2012年间下降了50.7%，其中42%的珊瑚死于长棘海星的周期性爆发。目前国际上针对长棘海星示踪与定量评估的技术，主要是通过ROV(遥控无人潜水器)和人工潜水调查，不但耗费大量的人力、物力，难以全面覆盖大面积的珊瑚礁区域，而且容易忽略长棘海星幼体，难以做到准确示踪水体中长棘海星的信息，因此关于长棘海星的有效示踪和预警仍是世界性的生态难题。
针对上述难题，本研究利用环境DNA (eDNA) 对物种高灵敏性的指征特性，结合电化学生物传感技术的便捷、高效、低成本和高特异性等优点，首次构建了长棘海星eDNA生物传感平台，实现长棘海星的实时快速检测，对示踪和预警长棘海星的暴发提供了新的方法和技术。
图1: (a) CoTS电化学生物传感器的构建流程图；(b-d) MoO2/C NF的形貌和结构谱图
本文的研究工作分为两个阶段：(1) 在实验室阶段使用电化学工作站对CoTS的合成DNA片段和gDNA进行检测；(2) 在现场使用电化学传感芯片对CoTS eDNA进行检测 (图1a)。利用SEM和TEM对电极材料MoO2/C NF进行表征 (图1b-d)，由花瓣状单元紧密堆积而成三维纳米花形貌，厚度均匀 (~ 10.0 nm)。组成单元在不同方向上堆叠而得到的褶皱形成了独特的开放通道，提高了材料的比表面积和孔隙率，提升电子在界面的传输效率。
图2: MoO2和MoO2/C NF的电化学性能表征
本文通过CV和EIS（图2a-b）表征并利用等效电路计算出C、MoO2和MoO2/C NF的Rct（界面电子转移电阻）分别为3600、560和90 Ω。说明MoO2/C NF具有较快的电荷转移动力学和理想的导电性。结合MoO2和MoO2/C NF在不同扫速（20-200 mV/s）下的CV曲线，通过Randles-Sevcik方程Ipa(mA)=2.69´105A´D1/2n3/2Cn1/2计算出两者电活性表面积分别为0.08 cm2和0.3 cm2。基于此，MoO2/C NF可作为理想的电极材料并用于构建高性能电化学生物传感器。
图3: 电化学生物传感器在构建过程中的分步电化学表征
电化学生物传感器在不同阶段具有不同的Rct值 (图3a)。当负载MoO2/C NF时，Rct减小；用戊二醛封闭材料活性位点后，钝化了电极材料表面，Rct增大；当负载了DNA探针后，由于带负电的磷酸骨架与 [Fe(CN)6]3-/4-之间产生了静电排斥力，导致Rct进一步增大。引入靶DNA后与DNA探针发生杂交反应，Rct减小，说明靶DNA可以通过DNA杂交反应来促进传感界面与溶液之间的电子转移过程。传感器在不同阶段的DPV结果 (图3b) 与EIS (图3a) 结果密切相关，表明电化学生物传感器构建成功。
图4: 所构建电化学生物传感器的灵敏性、特异性和选择性
在实验室阶段开展对CoTS的合成DNA片段的检测工作。发现峰值电流与合成DNA片段浓度呈正相关关系 (图4a)，这是因为DNA杂交的发生减少了电极表面的空间位阻，加快了界面电子转移。它们之间的关系可进一步描述为：y=1.2206x+11.527 (R2=0.979) (图4b)，并计算出LOD=0.147 ng/mL，这表明该传感器具备分析CoTS DNA的能力。选用不同的错配序列来检验生物传感器的特异性，当传感器与靶DNA杂交时产生了最大的峰值电流，而与错配的靶DNA杂交时电流降低 (图4c)，说明构建的DNA探针具有良好的特异性。另外，将生物传感器用于分别检测CoTS和其它生物的gDNA样本，发现仅对CoTS gDNA具有最大电流响应，而对其它样本gDNA的响应电流较弱，表明DNA探针对CoTS DNA具有极好的选择性 (图4d)。
表1: (a-b) 电化学生物传感器的可靠性验证
通过分析盲样，将结果与超微分光光度计和ddPCR进行比对 (表1a, b)，传感器的分析结果与超微光谱和ddPCR的分析结果没有显著差异，验证了该传感器的准确性。
图5: (a-b) 现场测试工作照片；(c-e) CoTS现场eDNA分析结果与对应的生态调查图
利用电化学生物传感器对海水样品进行现场分析，在SYM-LD 站点处(CoTS爆发点) 检测出CoTS eDNA浓度分别为0.33 ng/mL (1m)和0.26 ng/mL (10 m)。由于动态物理性质(如潮汐、洋流和垂直混合)，CoTS eDNA在海洋中的垂直分布相对均匀，因此，不同纵向深度的海水样品不会对CoTS eDNA的检测产生影响。根据生态调查，SYM-LD站点出的CoTS密度为500 ind/hm2 (图5d)，这与电化学检测结果接近。同时，还在SY站点 (无CoTS爆发) 处检测到0.19ng/mL的CoTS eDNA，但在该地的生态调查中未发现CoTS (图5e)，这可能与CoTS幼虫的存在有关，因为它们十分隐蔽而难以被观测。另外，在作为阴性对照的ZH3和ZH7站点处没有检测到CoTS eDNA，且该地区处也没有出现过CoTS爆发记录。以上现场分析结果充分说明了所构建的传感器具有很好的可靠性和准确性，能够满足在CoTS爆发前现场监测条件。
小结
本工作以MoO2/C NF为电极材料并采用特殊的DNA探针，开发出了高性能的CoTS电化学DNA生物传感器，并应用于其eDNA的现场检测。通过实验分析证明该传感器表现出优异的特异性和选择性。将该传感器用于现场分析海水水样，成功检测出CoTS eDNA的存在，且分析结果与水下生态调查结果高度一致，说明该传感器具有很好的可靠性，能够满足CoTS爆发前现场监测条件。因此，这种方法可以作为一种追踪低于爆发阈值的 CoTS 密度的新方法。研究结果对建立起可靠的监测与数据分析系统，为实现区域尺度上长棘海星的预警及生物防治提供有力的技术支持。
第一作者：王丽伟，广西大学海洋学院副教授，博士生导师/硕士生导师。目前主要从事海洋生物（珊瑚致病菌、共生藻、长棘海星等）标志物方面的快速检测、珊瑚白化预警和健康评估、海洋环境有机污染物的快速检测等研究。已主持国家自然科学基金1项，省部级项目7项，校级项目3项，并参与多项国家重大、重点项目和省部级重大项目。
联系方式：wangliwei@gxu.edu.cn
第二作者：徐家荣，广西大学资源环境与材料专业在读硕士研究生。主要研究方向为长棘海星eDNA的快速检测。
联系方式：928730332@qq.com
通讯作者：余克服，“长江学者”特聘教授、杰出青年基金获得者、广西大学 “八桂学者”特聘教授。多年专注于南海珊瑚礁地质、生态与环境研究，多次考察南沙群岛、西沙群岛、中沙群岛、海南岛、雷州半岛、涠洲岛和南海西岸的珊瑚礁。在历史时期珊瑚礁白化与恢复、珊瑚礁记录的全新世气候（温度、风暴、ElNino）事件与高分辨率气候过程、珊瑚礁记录的全新世海平面波动历史等方面取得研究进展。
联系方式：kefuyu@gxu.edu.cn
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