基础医学实验(十七)——ChIP
2022/12/28 13:55:35 阅读:173 发布者:
实验原理
在生理状态下把细胞内的染色质DNA和与其结合的蛋白质固定交联在一起,通过超声或酶切法将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来,以富集DNA片段,再通过多种下游检测技术(qPCR、测序等)来检测此富集片段的DNA序列;ChIP实验主要应用于:组蛋白及组蛋白修饰的研究;DNA结合的转录因子的研究;转录辅助因子的研究。
实验步骤
细胞准备--对于HeLa细胞,约为1-2x107个细胞,获得的染色质可用于10次免疫沉淀实验 (根据细胞和实验类型而不同)
酶解法
(1)终浓度为1%甲醛室温交联10min,建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接;
(2)交联反应结束后加入甘氨酸终止反应;
(3)细胞刮刀收集细胞于离心管中。预冷后离心收集细胞并洗涤;
(4)收集到的细胞用Buffer A重悬,细胞膜核膜“打孔剂”以便核酸酶进入;
(5)离心收集细胞核沉淀,用Buffer B重悬(两次);
(6)微球菌核酸酶消化染色质,37℃,20min;
(7)0.5M EDTA终止消化后,离心沉淀细胞核,并用ChIP buffer重悬;
(8)短暂超声(30%功率,20s,3次,每次大于30s间隔降温),彻底破坏细胞膜和核膜结构,让染色质得到完全释放;
(9)加入ChIP级抗体,孵育过夜,10ug染色质或者4×106个细胞可以做一次标准的ChIP
(10)加入Protein G磁珠,共孵育2h;
(11)3次低盐溶液漂洗,1次高盐溶液漂洗;
(12)洗脱ChIP染色质(65℃,30min),并解交联,2h 或者过夜解交联,Proteinase K处理消化蛋白质,释放DNA;
(13)利用DNA纯化柱进行ChIP DNA纯化。
超声法
(1)终浓度为1%甲醛室温交联10min,建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接;
(2)交联反应结束后加入甘氨酸终止反应;
(3)细胞刮刀收集细胞于离心管中,预冷后离心收集细胞并洗涤;
(4)每1-2×107细胞重悬于1ml ChIP细胞裂解液/超声缓冲液,冰上孵育10min;
(5)优化超声条件(超声后,进行核酸电泳,检测片段长度为200-1000bp,片段较长则再次超声)
(6)其余步骤同酶解法。
转自:“精英汇科研服务”微信公众号
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