MYC多聚体保护停滞的复制叉不受RNA聚合酶的影响

简介

2022年11月23日，来自德国维尔茨堡大学的Daniel Solvie及其团队在Nature (IF: 69.504)杂志上发表名为MYC multimers shield stalled replication forks from RNA polymerase的研究[1]。

主要结果

重组MYC蛋白在体外多聚化，促使我们研究MYC在细胞中是否均匀分布或形成更高阶结构。对不同MYC抗体识别的表位特征分析显示，单克隆抗体Y69只识别MYC的单个表位，不识别MYCN和MYCL蛋白。因此，我们使用荧光标记的Y69和直接随机光学重建显微镜 (dSTORM)来分析MYC在U2OS细胞中的分布 (图1a)。用抗体限制抗体浓度的稀释抗体染色确定了来自单个MYC分子的信号分布 (图1b)。在饱和抗体浓度下，我们在每个U2OS细胞核中检测到180,000 (±90,000)个MYC信号，这与之前对U2OS细胞的估计一致。对饱和和非常稀的抗体浓度下的信号分布进行的比较和数据模拟表明，一个MYC分子子集位于每簇数百个MYC分子的病灶中 (图1a,b)。在未受干扰的U2OS细胞中，4 - 14%的MYC分子定位于超过100个MYC分子的病灶中。在其他三个细胞系中获得略低的值。先前的估计表明，人类肿瘤细胞每个细胞核含有多达106个MYC分子。我们使用多西环素诱导的MYC表达来模拟这些水平。

MYC病灶是MYC多聚体形成的球体

在U2OS细胞中，使用两种不同探针标记的Y69抗体进行的邻近连接试验 (PLAs)显示病灶表面有强信号，表明它们包含多个近距离的MYC分子 (图1e)。来自表达两个携带不同标签的MYC等位基因的细胞的免疫共沉淀证实了稳健的免疫共沉淀。因此，我们将这些结构称为MYC多聚体。接受蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗的人类多发性骨髓瘤患者的MYC-MYC PLA也呈强阳性，而来自相同患者的预处理活检或正常造血组织的样本显示出更弱的PLA信号。我们再次观察到MYC蛋白在体外形成MYC-mcherry融合蛋白 (图1f)，用不同分子量的荧光标记的右旋糖酐进行渗透性分析，表明其具有拓扑封闭的表面。MYC的BR-HLH-LZ结构域的缺失并没有减少细胞内的多聚体形成，并且用MYC-MAX二聚体的小分子抑制剂10058-F4孵育细胞20对MYC形成多聚体的能力仅产生轻微影响，这表明与MAX的异源二聚体在多聚体中是耐受的，但不是MYC多聚体所必需的。

图1. MYC蛋白多聚体形成球状结构

MYC多聚体屏蔽复制叉

MYC多聚体包含肿瘤抑制蛋白BRCA1、FANCD2和RAD9，尽管相关性稍差，这些蛋白均与复制叉停止相关 (图2b和图3a，b)。与SPT5和EXOSC10不同，BRCA1和FANCD2被多聚体MYC形成的多聚体包围，而不是在壳内 (图3a，b)。MYC多聚体也包围着磷酸化的ATR激酶 (图3c)。值得注意的是，FANCD2, BRCA1和p-ATR主要存在于小的、非核仁的MYC多聚体中，这些多聚体在核仁断裂后持续存在；当核仁周围有MYC多聚体时，核仁BRCA1染色阳性。

图2. 多聚化将MYC从RNAPII中隔离

为了定位染色质上停滞的复制叉，我们对FANCD2和ATR使用了CUT&RUN测序；对照证实，这两种蛋白响应在羟基脲或阿非迪霉素诱导的复制应激而在染色质上积累。为了应对复制压力，FANCD2聚集在2,818个基因间位点和2,594个启动子近端位点，热图显示这些位点与ATR的结合位点重叠，正如预期的那样。这些数据与MYC染色质结合的比较表明，在MG-132处理后MYC积累的非启动子位点高度富集了FANCD2在响应复制应激时积累的位点 (图3d)。细胞暴露于羟基脲导致MYC染色质占用率的变化，这一变化与MG-132反应后观察到的变化高度相关，特别是在FANCD2峰附近的MYC结合大量增加 (图3e)。

图3. MYC的多聚化屏蔽了复制叉

结论及展望

本研究证明了MYC在转录延伸、mRNA剪接或蛋白酶体抑制的干扰下，从其活性启动子中的许多结合位点解离并形成多聚体，通常是球形结构。多聚化伴随着MYC相互作用组中涉及转录终止和RNA加工的蛋白质的整体变化。MYC多聚体聚集在紧挨着停滞的复制叉的染色质上，并围绕在位于停滞的复制叉的FANCD2、ATR和BRCA1蛋白周围。MYC多聚化以HUWE1和泛素化依赖的方式被触发。在有活性的启动子上，MYC多聚体阻断反义转录并稳定FANCD2与染色质的结合。这限制了S期DNA双链断裂的形成，表明MYC的多聚化能够使肿瘤细胞在应激条件下增殖。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05469-4

转自：“医学科研小坑”微信公众号

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