导读
益气散结（YQSJ）方治疗III期结直肠癌（CRC）的临床疗效已得到证实。然而，人们对潜在的抗肿瘤机制仍然知之甚少。本研究的目的是全面表征结直肠癌小鼠的结肠组织和粪便样本以及用YQSJ或其主要活性成分贝母素乙处理的结直肠癌细胞系中分子和微生物群的变化。串联质量标签的蛋白质组学和超高效液相色谱与飞行时间串联质谱代谢组学相结合，用于分析氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠诱导的CRC 小鼠结肠组织。结果表明，YQSJ处理后，所有检测到的组织蛋白中的0.8%（57/7568）和所有检测到的组织代谢物的3.2%（37/1141）发生了显着变化，分别富集了与结肠蛋白相关的 10 条通路以及代谢物相关的6条通路，富集的通路与炎症、鞘脂代谢和胆固醇代谢有关。我们对 YQSJ 治疗小鼠的粪便样本进行代谢组学分析，鉴定出121 种改变的粪便代谢物和7种富集途径，包括蛋白质消化和吸收途径。粪便样本的 16S rRNA 测序分析表明，YQSJ通过增加Ruminococcus_1和Prevotellaceae_UCG_001等有益细菌的水平来恢复CRC小鼠微生物群结构。在用贝母素乙处理的HCT-116 细胞中，蛋白质组学分析表明，在7152 种已鉴定的蛋白中，有1073 种发生了显着改变，并参与了 33条通路，包括 DNA 损伤修复、铁死亡和TGF-β 信号传导。本研究确定了YQSJ 抗肿瘤机制中涉及的关键调控元件（蛋白质/代谢物/细菌）和途径，表明结直肠癌的新潜在治疗靶点。
论文ID
原名：Integrative analysis and identification of key elements and pathways regulated by Traditional Chinese Medicine (Yiqi Sanjie formula) in colorectal cancer
译名：中药（益气散结方）调控结直肠癌关键要素及通路的整合分析与鉴定
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：5.988
发表时间：2022.12
通讯作者：饶军，郑智
通讯作者单位：江西省肿瘤医院，江西省人民医院
【期刊简介】
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实验结果
1.YQSJ处理小鼠结肠组织的蛋白质组学研究
我们对来自三组小鼠的结肠组织进行了病理学分析。CRC组平均每只小鼠结肠组织肿瘤数为5个，显着高于YQSJ组（平均每只小鼠2个肿瘤）和对照组（无肿瘤）。基于TMT的蛋白质组学方法用于鉴定 7568 种结肠组织蛋白，其中有 57 种在 YQSJ 治疗后发生显着改变 (p < .05)，倍数变化范围为 0.40 至 2.09（补充表 S1）。 YQSJ处理后有37个下调蛋白和20个上调蛋白。我们对 57 种显着改变的蛋白质进行 GO 富集分析，产生了 227 个显着富集的术语（p < .05；补充表 S2），其中 135 个与生物过程相关，包括细胞对转化生长因子 β 刺激的反应、对转化生长因子 β 的反应、细胞因子活性的调节和补体激活的调节。有 56 个丰富的分子功能术语，比如磷脂酰肌醇-4-磷酸结合、生长因子结合、硫化合物结合和转运蛋白活性。在细胞成分本体的36个富集术语中，排名前三的术语是I型胶原蛋白三聚体、III型胶原蛋白三聚体和树突棘质膜的细胞质侧。
显着改变的蛋白质的途径富集分析确定了属于五个不同功能组的 10 条显着富集的途径（表 1）。人类疾病组包括三个丰富的途径：阿米巴病、糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号传导和糖尿病性心肌病；有机体系统组也有蛋白质消化吸收、松弛素信号传导和血小板激活三种途径；代谢组包括糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素和糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素/肝素；环境信息处理组包括与信号转导相关的转化生长因子（TGF）-β信号通路；遗传信息处理组富集了硫传递系统通路。
表1 这57种显着改变的蛋白的KEGG通路富集分析
2.YQSJ处理小鼠结肠组织的代谢组学变化
结肠组织的 UPLC-TOF-MS/MS 代谢组学分析分别检测到 583 和 558 种命名代谢物的阳性和阴性模式。PCA分析表明，在两种电离模式下，来自 CRC 组的组织样本与来自 YQSJ 组的样本明显分离（补充图 S1）。监督 OPLS-DA 用于确定负责 PCA 分离的代谢物（图 1）。结果表明，YQSJ 处理后，21 种正电离模式的代谢物和 16 种负电离模式的代谢物（VIP ≥ 1 和 p ≤ .05）发生了显着变化。 CRC 组和 YQSJ 组之间的 37 种代谢物的比率范围为 0.51 至 9.61（补充表 S3）。 37 种代谢物中的大多数（37 种中的 27 种）减少，它们属于脂质和类脂分子。YQSJ处理增加的代谢物包括泛酸盐、胞嘧啶、尿素和木蜡酸。对这 37 种代谢物的 KEGG 分析表明，它们在 6 个途径中富集 (p < .05)，包括β-丙氨酸代谢、癌症中的中心碳代谢、ABC 转运蛋白、蛋白质消化和吸收、嘧啶代谢和胆固醇代谢（图 2） .
图1 OPLS-DA 分别在正模式和负模式下对代谢数据的结果。(A) 正模式下 CRC 和 YQSJ 组结肠组织样本的 OPLS-DA 模型得分图。(B) 正模式下 CRC 和 YQSJ 组结肠组织样本的 OPLS-DA 模型置换测试图。(C) 负模式下 CRC 和 YQSJ 组结肠组织样本的 OPLS-DA 模型得分图。(D) OPLS-DA 模型中 CRC 和 YQSJ 组结肠组织样本在负模式下的置换测试图。
图2 这37种显着改变的组织代谢物的KEGG通路富集分析。点的颜色表示p值，其大小表示富集的不同代谢物的数量。rich factor的值表示各通路中不同代谢物的数量与总代谢物的比值。
3.YQSJ处理小鼠粪便样本的代谢组学研究
我们进行了非靶向 UPLC-TOF-MS/MS 代谢组学分析以比较来自 CRC 和 YQSJ 小鼠的粪便样本，在阳性和阴性模式下分别测定了 1511 种和 721 种命名代谢物。此外，CRC 组有 227 种代谢物发生显着变化（VIP ≥ 1 和 p ≤ .05）（补充表 S4）。在 YQSJ 组中，有180种代谢物在 YQSJ 处理后发生显着改变（补充表 S5）。两组中的227种和 180 种变化代谢物之间有 59 种常见代谢物，除一个 (Pg 36:5) 外，所有代谢物都显示出一致的变化。因此，有 121 种显着变化的代谢物特定于 YQSJ 治疗（补充表 S6），包括 71 种减少和 50 种增加的代谢物，变化范围从0.05到325.14倍。KEGG 分析反馈了YQSJ 组中7种显着丰富 (p < .05) 的途径，包括神经活性配体-受体相互作用、产热、内分泌和其他因子调节的钙重吸收、蛋白质消化和吸收以及矿物质吸收（图 3）。
图3 这121种显着改变的粪便代谢物的KEGG通路富集分析。点的颜色表示p值，其大小表示富集的不同代谢物的数量。rich factor的值表示各通路中不同代谢物的数量与总代谢物的比值。
4.YQSJ处理的小鼠粪便样本的16S rRNA扩增子测序分析
门水平上最丰富的 11 种粪便细菌是拟杆菌门、厚壁菌门、Epsilonbacteraeota、Tenericutes、脱铁杆菌门、变形菌门、蓝菌门、Patescibacteria、放线菌门、疣微菌门等（补充图 S2）。尽管拟杆菌和厚壁菌门在 CRC 组和 YQSJ 组中均占优势，但与 CRC 组相比，YQSJ 粪便样本中的拟杆菌门数量较少，而厚壁菌门数量较多。在属水平上，乳酸杆菌和瘤胃菌科UCG-014增加，而Alloprevotella在YQSJ 处理后减少（补充图 S3）。 PCoA 分析显示，随着 CRC 的发展，肠道微生物群结构发生了显着变化（补充图 S4）。在YQSJ组中，小鼠肠道微生物群在治疗后发生了轻微变化，这表明YQSJ对一般微生物群结构的影响微乎其微。LEfSe 分析确定了 CRC 组（Model_B 和 Model_C）和 YQSJ 组（YQSJ_B 和 YQSJ_C 组）中的优势细菌（图 4、5；补充图 S5、S6）。Parabacteroides、Tannerellaceae、Eubacterium__xylanophilum_group、Ruminococcus_1和 Prevotellaceae_UCG_001在 CRC 和 YQSJ 组中均有富集。Ruminococcus_1和 Prevotellaceae_UCG_001表现出相反的变化模式，可能在肿瘤生长抑制中发挥重要作用。Prevotellaceae UCG-001是一种有益菌，具有抗炎作用，可缓解糖脂代谢紊乱。瘤胃球菌是产生短链脂肪酸丁酸盐的抗炎细菌。16S rRNA 测序结果表明，YQSJ通过调节肠道微生物群落来调节抗炎作用，从而改善 CRC 的发展。
图4 YQSJ组细菌群落结构 LEfSe 分析中的LDA评分。鲜明的颜色代表了YQSJ组的不同阶段。红色（YQSJ_B）表示YQSJ组在治疗前第27-28天收集小鼠粪便样本，而绿色（YQSJ_C）表示小鼠粪便样本在治疗后第66-67天（终点）收集的小组。“其他”代表未分类的微生物区系。
显示了分类单元 (|LDA| > 2)。
图5 YQSJ组细菌群落结构LEfSe分析中的分支图。分支图显示了粪便类群的差异。红色和绿色节点分别代表在红色和绿色组中起重要作用的微生物组。红色（YQSJ_B）表示YQSJ组治疗前第27-28天采集的小鼠粪便样本，绿色（YQSJ_C）代表治疗后第66-67天（终点）采集的小鼠粪便样本。“其他”代表未分类的微生物区系。
5.贝母素乙处理的HCT-116细胞的蛋白质组学研究
贝母素乙是YQSJ配方的主要活性成分。与之前的数据一致，贝母素乙处理诱导细胞凋亡并抑制 HCT-116 细胞的生长（补充图 S7）。HCT-116 细胞用 200 μM 的贝母素乙处理 48 小时，然后收集用于基于 DIA 的蛋白质组学研究。在通过 DIA 蛋白质组学方法鉴定的 7152 种蛋白中，有1073 种在贝母素乙处理后发生了显着改变（0.02 至 359.44 倍）（补充表 S7）。在1073种蛋白与YQSJ作用后结肠组织中发生显着变化的蛋白之间有63种共有的蛋白。在 63 种常见蛋白中，包括MAD2L1、MSH2、RFC4 和 SQSTM1在内的32种蛋白在HCT-116细胞和结肠组织中表现出相同的变化模式：13 种蛋白下调，19种蛋白上调。我们对这1073种蛋白进行GO富集分析，发现在生物过程类别中产生了3281个富集术语，在细胞成分类别中产生了451个富集术语，在分子功能类别中产生了178个富集术语（补充表 S8、S9、S10）。每个类别的前十个丰富术语显示在补充图 S8 中，比如细胞成分组织或生物发生、囊泡、细胞外外泌体和蛋白质结合。我们对1073种显着改变的蛋白进行 KEGG 通路富集分析，确定了32条富集通路。这32条途径属于六个不同的功能组：遗传信息处理、人类疾病、细胞过程、有机体系统、新陈代谢和环境信息处理（图 6）。代谢组包括氮代谢、鞘脂代谢和硒化合物代谢。遗传信息处理组包括DNA复制和错配修复途径等。细胞过程组有八个显着丰富的途径：内吞作用、吞噬体、过氧化物酶体、溶酶体、细胞周期、铁死亡、p53 信号通路和粘附连接。环境信息处理组包括ECM-受体相互作用、TGF-β 信号通路、Notch 信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用。有机体系统组只有一个途径，即补体和凝血级联反应。
图6 对1,073种显着改变的蛋白进行KEGG通路富集分析。每列代表一个途径，其高度表示富集的不同代谢物的数量。
讨论
TCM 可有效治疗 CRC，并可潜在地延缓癌症复发并抑制转移。我们之前表明，YQSJ联合 mFOLFOX6 术后辅助化疗可提高晚期 CRC 患者的生存率并降低副作用的发生率。 YQSJ 配方的主要活性成分贝母素乙通过SQSTM1得来的AMPK通路增加HCT-116细胞的自噬通量。中药具有多成分、多靶点的特点。因此，我们在本研究中采用蛋白质组学、代谢组学和16S rRNA扩增子测序等多组学技术，全面表征YQSJ配方和贝母素乙的抗肿瘤机制。
贝母素乙处理的 HCT-116 细胞的蛋白质组学分析表明，贝母素乙诱导铁死亡。铁死亡过程最近在癌症研究中引起了广泛关注，因为铁死亡损伤通过在肿瘤微环境中触发炎症相关的免疫抑制来促进肿瘤生长。铁死亡影响机体对化学疗法和免疫疗法的反应。例如，金属硫蛋白-1G通过抑制铁死亡促进索拉非尼耐药性。我们确定了六种参与铁死亡的蛋白，这些蛋白在对贝母素乙处理的反应中发生了显着变化：NCOA4、FTH1、SLC7A11、SLC39A14、STEAP3 和 TFRC。NCOA4 是促进铁死亡的关键分子，在 HCT-116 细胞中经过贝母素乙处理后上调超过26倍。在之前的一份报告中，我们发现包括谷氨酰胺、半胱氨酸和六种肽化合物在内的几种变化代谢物与铁死亡有关。综上所述，这些结果表明，贝母素乙诱导的铁死亡在逆转晚期 CRC 患者的化疗耐药中起着关键作用。与其他天然产物（包括青蒿琥酯和淫羊藿苷）类似，贝母素乙可能通过促进 DNA 损伤修复来发挥其对 CRC 的治疗作用。在HCT-116细胞中，贝母素乙影响某些细胞过程和遗传信息过程，例如细胞周期、DNA 复制和错配修复。贝母素乙显着下调MSH2和RFC4的表达，它们参与这些过程并与包括CRC在内的各种癌症相关。
贝母素乙的抗癌作用也可能与其抗炎活性有关。贝母素乙诱导HepG2细胞凋亡以逃避局部炎症反应和组织损伤。贝母素乙下调癌细胞中炎症细胞因子的表达，降低COX-2、TNF-α、IL-1β的水平，并抑制 NF-κB 信号传导。在 HCT-116 细胞和结肠组织的蛋白质组学研究中，TGF-β信号通路在贝母素乙或 YQSJ 配方处理后显着丰富。TGF-β充当肿瘤启动子，TGF-β 信号已被广泛用于癌症治疗。贝母素乙还调节两种与炎症相关的途径：细胞因子-细胞因子受体相互作用以及补体和凝血级联反应。细胞因子-细胞因子相互作用在调节包括癌症在内的各种疾病的炎症和免疫反应中起着重要作用。补体和凝血级联反应在调节癌症发展中的血栓炎症过程中起着至关重要的作用。其他几种重要的炎症相关通路，包括鞘脂代谢和胆固醇代谢，在贝母素乙或YQSJ处理后也发生了显着变化。鞘脂代谢和胆固醇代谢的失调与 CRC 进展相关。
人类肠道微生物群正在成为人类健康的关键参与者；它可以影响宿主免疫系统并在 CRC 发展中发挥重要作用。与饮食干预类似，TCM 可以调节肠道微生物组并改善炎症/代谢表型，对CRC发挥保护作用。有研究表明葛根芩连汤通过重塑肠道微生物群和相应的肿瘤微环境来提高 PD-1 阻断在 CRC 中的作用。在这项研究中，我们发现YQSJ可调节 AOM/DSS 诱导的CRC小鼠肠道菌群的组成，并延缓CRC的发展。YQSJ增加了有益细菌的水平，例如 Ruminococcus_1和Prevotellaceae_UCG_001。厚壁菌门在维持肠道内稳态方面发挥着重要作用，从而对人类健康产生积极影响，在 YQSJ 治疗后显着增加。正如蛋白质组学、代谢组学和 16S rRNA 扩增子测序结果所表明的那样，YQSJ 处理显着丰富了蛋白质消化和吸收途径。这些发现表明，蛋白质消化和吸收途径是YQSJ的一个靶点，并且可能是治疗结直肠癌的一个潜在靶点，因为它涉及多种类型的癌症，包括乳头状甲状腺癌、胃癌和乳腺癌。
结论
在这项多组学研究中，我们确定了由 YQSJ 或其主要活性成分海藻碱引起的分子和微生物群变化。YQSJ对CRC治疗作用所涉及的关键调控元件或通路包括DNA损伤修复、铁死亡和几种炎症相关通路。YQSJ配方对CRC的有益作用可能是通过调节肠道微生物组以增加有益细菌的相对含量来介导的。目前的研究结果为YQSJ/贝母素乙的抗肿瘤机制提供了新的见解，并扩展了我们对YQSJ在CRC中的治疗应用的理解。目前的综合蛋白质组学和代谢组学分析确定了在CRC中YQSJ/贝母素乙治疗显着改变的蛋白质和代谢物；然而，我们需要更多的研究来通过在动物模型或细胞实验中操纵特定的蛋白或代谢物靶标以探索这些变化背后的精确机制。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.1090599/full
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