化学反应介导的细菌共价定位

背景

微生物-宿主相互作用对人类健康至关重要，主要与细菌的定植行为有关。有益和共生细菌的充分定植，通过保持平衡的微生物群结构来预防和治疗疾病，以维持宿主的代谢和免疫稳态至关重要。在自然环境中，微生物的定植主要依赖于细菌表面与体内各种生物界面之间的相互作用。例如，细菌进化到表达多种表面黏附素以促进界面黏附，这有助于促进胞外黏多糖合成和生物膜形成，从而增强定植。因此，能够控制细菌与周围环境界面相互作用的方法对于控制微生物定植具有重要意义。

简介

2022年12月17日，来自中国上海交通大学的Huilong Luo及其团队在Nat Commun (IF: 17.694)杂志上发表名为Chemical reaction-mediated covalent localization of bacteria的研究[1]。

主要结果

在这里，我们提出了一个通过化学方法调节细菌-宿主界面相互作用来控制细菌定位的概念，并展示了它在开发细菌疗法中的应用，特别是增加在富含黏蛋白的组织表面的积聚的能力。在细胞相容的条件下，通过简单的一步亚胺酯反应，可以将多种细菌表面丰富的初级氨基残基转化为游离巯基 (图1a)。表面硫代作用产生化学反应活性活细菌，其能够通过动态硫醇-二硫化物交换反应形成新的二硫键，从而与多聚体富集 (二硫化物)的粘液层自发连接 (图1b)。由于能够形成共价键，表面巯基化细菌在靶向和定植具有黏液特征的组织方面表现出优势。与未经修饰的细菌相比，表面巯基数量优化后的活性细菌在富含黏蛋白的空肠中的附着能力提高了170倍，这对肠道微生物的定植具有挑战性。作为微生物群移植的概念验证应用实例，我们将治疗性大肠杆菌Nissel 1917 (EcN)转化为具有巯基化表面的大肠杆菌，并发现口服递送生物正交EcN可显著促进与空肠粘膜炎相关的炎症缓解。鉴于共价键辅助定位的特点，我们预计赋予细菌反应性表面可以为制备各种功能性活性生物制剂提供一种稳健的方法。

图1. 化学反应介导的细菌共价定位示意图

为了确保对细菌活性和增殖的影响可以忽略不计，首先针对表面硫代化优化了反应时间。在与2-亚氨基硫杂环戊烷反应不同时间间隔后，通过LB琼脂平板细菌计数法检测2-亚氨基硫醚对EcN的细胞毒性。如图2a所示，EcN的存活率随反应时间的延长而降低，延长至150 分钟后，EcN的活力明显降低。进一步在90分钟反应时间下筛选2-亚氨基硫醚浓度为0-400µg/ml的浓度，图2b绘制的活力变化趋势显示出剂量依赖性的细胞毒性。当浓度小于100µg/ml时，对细菌活力的影响有限。为了检查表面硫代作用是否影响EcN的生长，用100% LB培养修饰的EcN (EcN@SH)，记录11小时的生长曲线，发现浓度低于50µg/ml时影响不显著 (图2c)。通过考马斯染色分析从EcN和EcN@SH中提取的总蛋白。总体细菌蛋白组成未受影响，且在硫代化后未观察到因子的加成产物。色氨酸代谢也被用来检测硫代化对硫代化细菌代谢活性的影响。由于许多细菌可以将色氨酸代谢成特定的代谢物，如吲哚及其衍生物，因此我们采用吲哚试验来评估硫代化细菌通过色氨酸酶降解色氨酸的能力。生成的吲哚浓度采用高效液相色谱法进行定量分析。如预期，在天然细菌和硫代化细菌之间的吲哚生成中没有观察到显著差异，验证了硫代化对细菌的色氨酸代谢没有显著影响。

图2. 表面巯基化细菌的制备、表征及反应性

表面巯基化细菌与粘蛋白的反应

在确认了硫醇化细菌表面的硫醇的反应性后，我们接下来研究了修饰的EcN和粘蛋白之间通过动态硫醇-二硫化物交换的无催化剂反应 (图4a)。使用流式细胞术在PBS中研究了修饰细菌上的表面游离巯基随时间的变化。随着培养时间延长至2小时，新形成的硫醇消失了一半。培养2小时后，硫醇水平下降缓慢得多，随着时间延长至12小时，硫醇水平回到天然EcN的基线。这些结果表明，新形成的硫醇在EcN@SH表面相对较长时间地保留，用于硫醇-二硫化物交换反应。为便于检测，在37℃下与Cy5.5-NHS酯化3小时，制备Cy5.5标记黏蛋白 (Cy5.5 _黏蛋白)，产物经超滤纯化。3*108个菌落形成单位 (CFUs)的巯基化EcN与0.03 mg/ml的Cy5.5 _黏蛋白直接孵育1小时后，与天然细菌相比，单个细菌的MFI显著增加 (图4b)。

也就是说，Cy5 _黏蛋白与硫代化细菌的结合受到L-抗坏血酸的影响，这归因于还原剂对硫代二硫化物交换反应的阻断。同时，LSCM成像也得到类似结果，显示在加入L-抗坏血酸后，巯基化EcN上荧光标记的Cy5 _黏蛋白的存在被显著抑制 (图4j)。这些结果与既往的报道非常一致，即通过巯基-二硫化物交换介导的细胞摄取可以被还原剂抑制。此外，二硫苏糖醇 (DTT)可以减少二硫键，用于裂解EcN@SH和粘蛋白之间新形成的二硫化物。除还原剂外，含二硒的硒代半胱氨酸 (SeCA)作为模拟底物与二硫化物竞争与硫醇交换，被用于抑制EcN@SH与粘蛋白之间的反应。简而言之，这些数据证实了巯基化细菌通过巯基-二硫键交换形成二硫键，从而与富含半胱氨酸的粘蛋白结合。

图4. 表面巯基化细菌与粘蛋白的反应

结论及展望

能够操纵细菌定殖的方法对于调节宿主-微生物群关系具有重要意义。本文介绍了一种原位化学反应介导的细菌共价定位策略。通过简单的一步酰亚胺酯反应，细菌表面的伯氨基可以在细胞相容的条件下转化为游离硫醇。表面硫代化适用于修饰不同的菌株，通过改变进料比例可以很容易地调节每种细菌引入的硫醇数量。这些化学反应性细菌能够通过粘蛋白结合的二硫化物与细菌表面新转化的硫醇之间无催化剂的硫醇-二硫化物交换与粘液层自发结合，并表现出硫代化水平依赖性附着。用每细胞9.3*107个硫醇优化的细菌在富含粘蛋白的空肠中的黏附能力提高了170倍，这是肠道微生物群难以定植的地方。作为微生物群移植的概念验证应用，口服益生菌在空肠中的共价键辅助定位可改善空肠粘膜炎的缓解。我们的研究结果表明，转化具有反应性表面的细菌提供了一种化学控制细菌定位的方法，这是开发下一代细菌活生物制剂的理想方法。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41467-022-35579-6

转自：“生物医学科研之家”微信公众号

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