优化的引导编辑技术可以在玉米中高效诱导可遗传突变

以下文章来源于JIPB ，作者JIPB

引导编辑（Prime editing）是衍生于CRISPR/Cas系统的新一代精准基因组编辑技术，能够实现任意碱基的替换或小片段的删除或插入，具有重要应用前景(Anzalone et al., 2019)。然而，引导编辑器（Prime editor, PE）在植物中的编辑效率普遍偏低，限制了其在植物中的应用。最近，哈佛大学的David Liu团队通过3种优化策略在哺乳动物细胞中大幅提高了PE的效率，包括：（1）在pegRNAs的3’端添加结构化的RNA基序evopreQ1，通过阻止pegRNAs的降解来提高pegRNAs的稳定性，命名为epegRNAs(Nelson et al., 2022);（2）优化PE2蛋白，得到PEmax;（3）通过过表达活性结构域被破坏的MLH1蛋白(MLH1dn)来抑制DNA错配修复途径(Chen et al., 2021)。尽管优化的PE在水稻中得到验证(Jiang et al., 2022; Li et al., 2022a; Li et al., 2022b; Xu et al., 2022; Zong et al., 2022; Zou et al., 2022), 但在玉米中的表现如何仍不清楚。

JIPB近日在线发表了中国农业大学陈其军课题组题为“Optimized prime editing efficiently generates heritable mutations in maize”（https://doi.org‍/10.11‍1‍1/jip‍b‍.‍1‍3428）的研究论文。该研究在玉米中测试了基于上述三种策略优化的PE。结果表明，优化的PE能够高效诱导产生可遗传的纯合和杂合玉米突变株系。该研究也为培育不含转基因成分的抗除草剂玉米品种奠定了坚实的基础。

为了在测试PE优化效果的同时获得除草剂抗性突变株系，作者选择了ZmALS1&2基因的W542和S621靶点，ZmACC1基因的W2284G靶点，ZmEPSPS基因的TAP靶点。已知这些靶点的对应氨基酸突变可以使水稻获得除草剂抗性。对这四个靶点的编辑效率进行分析发现，优化后的PE可以在这四个靶点高效诱导纯合或杂合突变。在ZmEPSPS基因TAP靶点，相较于ePE3max对照组，ePE5max可以更加高效地诱导产生纯合突变株系。针对ZmALS1&2基因的W542和S621双靶点的优化PE，无论是使用来自玉米的ZmMLH1dn(ePE5max-W&S-1)还是使用来自于水稻的OsMLH1dn (ePE5max-W&S-2)抑制DNA错配修复途径，均可以产生双基因双靶点的纯合和杂合突变体，从而在玉米中实现了同时对多基因多靶点的可遗传精准编辑。

为了证实T0株系中突变的可遗传性以及除草剂抗性，作者对部分T1株系进行了分析。作者获得了T-DNA free的纯合突变株系，为T0株系中突变的可遗传性提供了证据。作者接着对不含转基因成分的突变体分别喷施对应的除草剂，发现除ZmACC1基因W2284G突变产生的除草剂抗性较弱外，ZmEPSPS的TAP-IVS突变和ZmALS1&2的W542L和S621I突变均产生了很强的除草剂抗性。

图1.优化的PE在四基因四靶点高效诱导产生抗除草剂玉米株系

（A）优化的PE在ZmALS1&2，ZmACC1和ZmEPSPS四基因四靶点中的编辑效率;

（B）优化的PE同时靶向ZmALS1&2双基因的W542&S621双靶点时的编辑效率;

（C）T1代T-DNA free纯合突变玉米幼苗对草甘膦的抗性分析;

（D）T1代T-DNA free纯合突变玉米幼苗对ACC抑制剂类除草剂的抗性分析;

（E）T1代T-DNA free纯合突变玉米幼苗对ALS抑制剂类除草剂的抗性分析。

综上，优化的PE可为玉米精准基因组编辑提供具有实用性的工具，也为不含转基因成分的玉米除草剂抗性育种奠定了坚实的基础。

陈其军课题组近年来在PE工具开发及优化方面取得了一系列进展，在引导编辑试剂递送（基于pGreen3新型三元载体系统）以及pegRNA表达（Pol2-Pol3复合型启动子）方面具有独特性，且具有这些特性的PE工具在水稻(Jiang et al., 2022)和玉米(Jiang et al., 2020)中的应用效果良好。这篇文章通过三个方面的优化使PE在玉米中的编辑效率得到进一步提高，大大增强了PE在玉米精准基因组编辑中的实用性。博士生乔德鑫和王俊雅以及中国农业大学作物分子育种平台的逯敏慧博士为该论文的共同第一作者，陈其军教授为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金的资助。

转自：“iPlants”微信公众号

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