以下文章来源于ProteintechGroup ，作者研发部
经常做细胞实验的你，想必一定遇到过这个难题：细胞收集，究竟哪种方案最合适？
离心收集or瓶内裂解or胰酶消化？
同为科研人员的小P也不例外，曾被这个难题困扰良久，尤其是看了大量的蛋白样品制备的相关文章后，变得更加的不坚定了。
有的文章推荐离心法，操作方便且高效；有的文章则推荐瓶内裂解，能最大程度保持细胞蛋白谱的完整性；还有的则推荐胰酶消化法，保持细胞形态单一，不聚团。
貌似每种方法都可以，但是应用于实验中结果却不尽人意，就如同金庸笔下段誉的六脉神剑，时灵时不灵。究竟是什么原因造成的呢？
在不断地实验、不断地反思之后，小P终于找到了答案。
给大家解惑之前，我们首先思考一下这么一个问题：一款合格的WB蛋白样品应该是怎样的？
倒数3秒钟，3...2...1... 你找到答案了吗？
小P认为，一款合格的WB蛋白样品最基本的要求是：充分保留样品蛋白质图谱完整性和蛋白质完整性，保证蛋白处于充分溶解状态且无外来蛋白污染。
何为蛋白质图谱完整性：即提取到样品中所有蛋白质；何为蛋白质完整性：即蛋白无降解、无聚集、无沉淀、无去修饰等。
依照这个标准，我们再来分析一下上述三种细胞收集方法的优缺点。
01
细胞收集方法优劣对比
离心法
优点：离心法操作方便，同时我们可根据收集到的细胞沉淀来加入适量的裂解液，从而能够控制样品蛋白的浓度。
缺点：在离心过程中却容易造成细胞破碎而降低总蛋白得率，同时会造成细胞外基质（ECM）的丢失，从而造成样品蛋白质图谱的不完整。
注：细胞外基质（ECM）是由细胞外大分子和矿物质（如胶原蛋白、酶、糖蛋白和羟基磷灰石）组成的三维网络，为周围细胞提供结构和生化支持。因为多细胞在不同的多细胞谱系中独立进化，细胞外基质的组成因多细胞结构而异；然而，细胞粘附、细胞间通讯和分化是ECM的常见功能。细胞外基质主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，按分布部位划分主要分为基底膜（Basement membrane）和间质基质(Interstitial matrix)
瓶内裂解法
优点：瓶内裂解法最大的优点是可以有效的防止细胞在离心过程中破碎，能有效的提高总蛋白得率，同时也能完整的保留细胞外基质（ECM）。
缺点：操作会相对复杂，且不易控制加入的裂解液量，往往会造成总蛋白浓度低且粘度高等情况；对于一些药物处理的细胞和贴壁不牢的细胞，使用此方法在清洗阶段也容易造成细胞大量丢失。
胰酶消化法
优点：胰酶处理的细胞个体形态单一，不聚团，对细胞损伤小。
缺点：会造成细胞外基质（ECM）的完全丢失，同时会剪切一些对胰酶敏感的蛋白，如上图右。
对于WB蛋白样品中是否含有对胰酶敏感的蛋白，我们往往不太确定，同时胰蛋白酶也属于外来蛋白质，如果不能做到彻底清除，同样会污染我们的样本。所以用于WB的细胞样品不建议使用胰酶消化法收集细胞。
看到这里，文首的难题，想必大家已经有了答案。
每一种方法都有自己的优势和局限性，我们要根据自己的细胞类型选择合适的细胞收集方式。
离心法：适用于悬浮细胞、贴壁不牢和药物处理过的细胞；
瓶内裂解法：适用于所有的贴壁细胞；
胰酶消化法：适用于目的蛋白非细胞外基质（ECM）或对胰酶不敏感的蛋白。
在一般情况下，我们首推瓶内裂解法，其次离心法；不推荐胰酶消化法。
02
细胞收集protocol
了解了三个方法的优劣，选择了最合适的细胞收集方法，那具体该如何操作呢？小P这里也给大家准备了瓶内裂解法和离心法的详细Protocol，请查收：
a. 瓶内裂解法（效果最佳）：适用于所有的贴壁细胞
1）吸净培养基，用冰的PBS清洗细胞表面2遍（动作轻柔，防止细胞脱落），尽可能吸取残留的PBS。
2）在冰上加入适量预冷的裂解液于细胞瓶、培养板或培养皿中，用移液管吹散贴壁的细胞，对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集，收集裂解液，在冰上放置30min，期间每10min上下颠倒混匀一次。
b. 离心法：适用于悬浮细胞、贴壁不牢和药物处理过的细胞
1）使用细胞刮收集细胞悬液（连同培养基一起收集），4℃，500g离心5min，收集沉淀，沉淀用预冷的PBS洗涤两遍，收集细胞沉淀，尽可能吸取残留的PBS。
2）加入适量的裂解液，在冰上放置30min，期间每10min上下颠倒混匀一次。
注：裂解液在使用前提前加入蛋白酶抑制剂，用于磷酸化抗体检测的需要同时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
看到这里，各位科研同仁们应该已经完全掌握了吧~
转自：“医学科研小坑”微信公众号
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