研究背景：
细胞外囊泡(EV)介导细胞-细胞和器官间的通信，并在多细胞生物中维持体内稳态和健康。据文献报道肺肿瘤可远程激活骨骼中的成骨细胞，并从骨髓中诱导中性粒细胞促进肿瘤生长；而基于EV的DNA分泌被认为通过从细胞中排出有害DNA来促进细胞稳态和减少线粒体损伤。
基于此，作者想要探究生理EV如何在体内发挥稳态或病理功能。
研究成果：
2022年5月20日，北京大学基础医学院尹玉新教授团队在Journal of Extracellular Vesicles（IF=17.337）杂志上发表题为“Extracellular vesicles from lung tissue drive bone marrow neutrophil recruitment in inflammation”的文章。作者开发并验证了肺部组织来源的EVs分离方案，以精确测定其分子组成和研究其在体内的生理功能。研究证实肺 EV 通过传递双链 DNA (dsDNA) 促进骨髓中中性粒细胞的趋化性，为肺EV增强宿主对细菌感染的免疫应答建立了分子基础，并为理解囊泡介导的系统通信提供了新的见解。
原文连接：
https://doi.org/10.1002/jev2.12223
研究过程与结果：
1.肺 EV 的分离与鉴定
作者开发并优化了一种基于差异离心的方案，肺细胞在消化过程中能够得到很好的保护，不会影响 EV 特征。在小鼠样本中，EV 相关蛋白(ALIX、TSG101、CD9、CD81)高度富集，而高尔基体、内质网和线粒体蛋白检测不到或仅微弱存在。人类样品中 EV 标记蛋白存在类似富集，并且与已知的 EV 特征一致（图1）。
这些结果表明，改进的分离方法可以有效地从人类和小鼠的肺组织中收集到高质量 EV，并显示其理化性质和特征。
图 1. 从人和鼠肺组织中收集高质量的 EV
2. 人和小鼠肺 EV 蛋白质组学分析
与肺组织细胞相比，肺 EV 显示出不同的蛋白质谱。除了经典的 EV 标志物外，还鉴定了肺特异性 EV 标志物（GPRC5A、AGER）。此外，人类和鼠肺 EV 的蛋白质组有一半以上是相同的。基因本土（GO）富集分析，无论何种物种，肺 EV 蛋白都高度富集到“细胞外泌体”和“质膜”，显示了 EV 蛋白的囊泡和细胞外性质（图2）。
图 2. 蛋白质分析证明肺 EV 的囊泡和组织特异性
3. ATII（Ⅱ型肺上皮细胞）是肺部EV的主要来源
在人和小鼠样本中，ATII 可以标记大多数 EV，表明 ATII 是肺组织 EV 的主要来源。人的样本中单个成纤维细胞释放的 EV 最多，而小鼠样本中的 ATI（I型肺上皮细胞）细胞释放的最多。实验结果表明所有非免疫细胞中的 EV 分泌相关基因显著富集且表达上调（图3）。 通过高通量检测证实 ATII 细胞是肺 EV 的主要来源，且非免疫细胞通常比免疫细胞释放更多的 EV。
图 3. EV 蛋白质组学分析和 scRNA 序列数据评估
4. 肺 EV 含有 dsDNA
dsDNA 分布于低密度肺 EV 和高密度非囊泡成分中。流式可成功识别肺 EV。DAPI 染色后发现肺 EV 包含不同长度的 dsDNA 片段，横跨所有染色体。细胞 DNA 和 EV DNA 的拷贝数变异(CNVs)非常相似（图4 G-I）。表明肺 EV 中的 dsDNA 源于基因组 DNA 且存在于表面和内部。
图 4. 肺 EV 含有来源于基因组 DNA 的双链 DNA
5. 肺内 EV 在骨髓中性粒细胞中积聚
为评估肺 EV 在小鼠体内的生物分布，将 rd 标记的肺 EV 静脉注入 C57BL/6 小鼠体内，以 dir 标记的脂质体作为对照。然后使用体内成像系统(IVIS)对这些动物进行检查。通过共聚焦显微镜，作者观察到红色荧光标记的肺 EV 与中性粒细胞共定位，确定为 CD45+ Ly6G+ 细胞（图5）。表明肺 EV 通过血管转移到骨髓中性粒细胞。
图 5. 荧光标记的肺 EV 被转移到骨髓中
6.肺EV-DNA增强中性粒细胞趋化性
注射肺 EV 的小鼠腹腔灌洗部位的中性粒细胞数量呈剂量依赖性增加而外周血中性粒细胞数量无差异。表明肺EV促进中性粒细胞迁移，而不是增加其在外周血的数量。DNaseI 处理后只减少了 DNA 的数量，而不影响蛋白质、RNA 水平，或减少 EV 数量，表明肺 EV-DNA 负责趋化性的上调（图6）。表明肺 EV-DNA 参与调节中性粒细胞的趋化性。
图 6. 肺 EV-DNA 增强中性粒细胞的趋化性
7. TLR9 在中性粒细胞中感知肺 EV-DNA
作者检测肺 EV-DNA 诱导中性粒细胞趋化的分子途径，并探究 TLR9 是否在肺EV中感知 DNA。发现TLR9 具有肺 EV-DNA 的检测能力，且肺 EV-DNA 通过 TLR9 信号通路可触发中性粒细胞动员趋化因子的释放。表明肺 EV 分泌的抑制或肺 EV-DNA 的破坏足以损害骨髓中性粒细胞产生趋化因子，从而导致疾病的发生。
图 7. 肺 EV-DNA 通过 TLR9 信号触发中性粒细胞动员趋化因子释放
8. 肺 EV 增强沙门氏菌感染中的中性粒细胞募集
肺 EV 可以有效地增强中性粒细胞的募集，抑制肺 EV 的分泌会导致中性粒细胞趋化性损伤，从而降低宿主的免疫防御。研究确定了中性粒细胞对肺 EV-DNA 的调控机制在沙门氏菌感染和肺 EV 治疗过程中也起作用。
转自：“学术查”微信公众号
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