来源：微科盟原创微文
导读
红景天苷(SAL)是从红景天中提取的天然成分，具有抗炎和抗氧化作用。本研究的目的是证明SAL 对哮喘的作用和作用机制。我们使用卵清蛋白(OVA)诱导哮喘小鼠模型，然后用SAL进行治疗。我们首先检测了SAL对哮喘小鼠的治疗作用；其次研究了SAL对哮喘小鼠气道炎症反应、氧化应激和气道重塑的影响；最后，我们使用非靶向代谢组学分析来探讨了SAL 对哮喘小鼠血清代谢物的影响。结果发现，SAL对哮喘模型小鼠有明显的治疗作用；此外，SAL治疗降低了支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和 IL-13的水平，但升高了IFN-γ和IL-10的水平，并且还增加了肺中的SOD和GSH-Px活性并降低了MDA水平。此外，SAL 处理的小鼠肺中平滑肌肌动蛋白、基质金属肽酶2、基质金属肽酶9和转化生长因子β1的表达减少。非靶向代谢组学分析显示肺中有 31种代谢物受 SAL影响。这些代谢物与嘧啶代谢、类固醇激素生物合成和三羧酸（TCA）循环有关。我们的研究表明，SAL可以减少哮喘模型小鼠的炎症反应、氧化、气道重塑。SAL治疗哮喘的机制可能与调节嘧啶代谢、类固醇激素生物合成和TCA循环有关。
论文ID
原名：Mechanic study of salidroside on ovalbumin-induced asthmatic model mice based on untargeted metabolomics analysis
译名：基于非靶向代谢组学分析红景天苷对卵清蛋白诱导的哮喘模型小鼠的作用机制研究
期刊：Food Function
IF：6.317
发表时间：2022.11
通讯作者：崔换天，胡海波，陆学超
通讯作者单位：山东大学，青岛市中医医院
实验结果
1.SAL对哮喘模型小鼠的治疗作用
本研究中，地塞米松（DXM）、SAL 低剂量组和SAL高剂量组的小鼠每天分别被灌胃2 mg/kg的DXM、24 mg/kg和48 mg/kg的 SAL，持续4周（图1）。不同浓度乙酰胆碱（Ach）处理后模型组Penh值（气道阻力值）显着高于对照组（都分别对应为P<0.01）。6.25 mg/mL Ach处理后DXM和SAL高剂量组Penh值较模型组显着降低（都分别对应为P<0.01）；在 12.5 mg/mL Ach 处理后，DXM（P<0.01）、SAL 低剂量（P<0.05）和 SAL 高剂量（P<0.01）组的 Penh 值显着降低； DXM 和 SAL 高剂量组的 Penh 值在 25 mg/mL Ach 处理后显着降低（都分别对应为 P <0.05）；DXM (P<0.01)、SAL 低剂量组 (P<0.05) 和 SAL 高剂量组 (P<0.01) 中的 Penh 值在 50 mg/mL ACh 处理后显着降低（表 1）。
与对照组相比，哮喘小鼠的肺组织湿干重（W/D）比值显着升高（P<0.01）。与模型组相比，DXM 和 SAL 高剂量治疗组的比率显着降低（都分别对应为 P < 0.01，图 2A）。与对照组相比，模型组支气管肺泡灌洗液（BALF）上清液总蛋白含量显着升高（P<0.01）；然而，它在 DXM (P<0.01)、SAL 低剂量 (P<0.05) 和 SAL 高剂量 (P<0.01) 组中显着降低（图 2B）。与对照组和模型组相比，模型组BALF总细胞计数显着增加（P<0.01），而DXM、低剂量和高剂量SAL治疗组显着降低（都对应为P<0.01，图 2C）。与对照组相比，模型组BALF中嗜酸性粒细胞增多（P<0.01）。然而，与模型组相比，DXM、SAL低剂量组和SAL高剂量组BALF中的嗜酸性粒细胞水平较低（都分别对应为P<0.01，图2D）。此外，与对照组相比，模型组血清 IgE 水平升高（P<0.01），但与模型组相比，DXM、SAL 低剂量组和 SAL 高剂量组显着降低（都分别对应为P<0.01，图2E)。
HE染色显示对照组肺组织未见病理改变。模型组支气管上皮细胞排列不规则，可见大量炎性细胞。 DXM 和 SAL 治疗改善了肺部的这些病理变化（图 3A）。同样，模型组炎症评分显着高于对照组（P<0.01）。然而，与模型组相比，DXM (P<0.01)、SAL 低剂量组 (P<0.05) 和 SAL 高剂量组 (P<0.01) 的炎症评分较低（图 3C）。Masson染色显示模型组肺部有明显的胶原沉积，与模型组相比，DXM和SAL治疗小鼠肺部胶原含量较少（图3B）。模型组Masson评分高于对照组（P<0.01），DXM和SAL高剂量组（都分别对应为P<0.01）低于模型组（图3D）。
图1 本研究的实验设计和给药方案
图2 SAL 治疗改善了小鼠的哮喘。(A) SAL 处理降低了 W/D 比率。(B) SAL处理降低了BALF中的总蛋白质含量。(C) SAL处理降低了BALF中的总细胞计数。(D) SAL 减少了BALF中的嗜酸性粒细胞计数。(E) SAL处理降低了血清中IgE的水平。*：P<0.05；**：P<0.01；ns：无统计学意义。
图3 SAL减轻了哮喘模型小鼠的病理变化。(A、C)HE染色显示SAL减少了肺(A)中炎症细胞的浸润和气道上皮细胞损伤(红色箭头表示气道上皮细胞损伤，黑色箭头表示炎症细胞浸润)，降低了HE评分 (C)（放大倍数：100×）。(B, D) Masson 染色显示 SAL 减少了肺中胶原含量的沉积 (B) 并降低了Masson评分 (D)（放大倍数：100×）。
表1 SAL对哮喘小鼠Penh的影响
对照组、模型组、DXM、SAL低剂量组和SAL高剂量组（每组n=10）。##：与对照组相比P<0.01；*：与模型组比较P<0.05；**：与模型组相比，P<0.01。
2.SAL 对哮喘小鼠炎症和氧化应激的影响
我们测量 BALF 中的细胞因子水平以了解SAL如何影响模型小鼠的炎症。除了肺组织匀浆中的SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性外，我们还测试了丙二醛（MDA）水平，以评估 SAL 对氧化应激的影响。 ELISA结果显示，与对照组相比，模型组IL-4、IL-5、IL-13水平如预期升高（P<0.01），而DXM组这些细胞因子水平较对照组显着降低模型组（都分别对应为P < 0.01）。 SAL 治疗以剂量依赖性方式降低 IL-4、IL-5 和 IL-13 水平（图 4A-4C）。模型组IFN-γ、IL-10水平低于对照组(都分别对应为P<0.01)。与模型组相比，DXM 和 SAL 高剂量治疗均升高了 IFN-γ 和 IL-10的水平（都分别对应为P < 0.01，图 4D、4E）。
与对照组相比，模型组SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平升高（都分别对应为P<0.01），而与模型组相比，SAL高剂量组SOD、GSH-Px活性升高，MDA水平降低 (分别为P<0.05, P<0.01 P<0.05,表2)。
图4 SAL治疗抑制了哮喘小鼠的炎症反应。ELISA法检测各组BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ和IL-10细胞因子水平。结果表明，SAL处理降低了BALF中IL-4(A)、IL-5(B)和IL-13(C)的水平，并增加了IFN-γ(D)和IL-10(E) 的水平。
表2 SAL对哮喘模型小鼠肺组织匀浆SOD、GSH-Px活性及MDA水平的影响
3.SAL对哮喘小鼠气道重塑的影响
我们进行了免疫组织化学染色，通过肺中α-SMA、MMP2、MMP9和TGF-β1的表达研究SAL对气道重塑的影响。结果显示，模型组小鼠肺组织中α-SMA、MMP2、MMP9、TGFβ1的表达较对照组显着升高（分别为P<0.01，P<0.01，P<0.05，P <0.01），而 DXM 和高剂量 SAL 处理降低了 α-SMA（都分别对应为P<0.01，图 5A、5B）、MMP2（都分别对应为P<0.01，图 5A、5C）、MMP9（都分别对应为P<0.05，图 5A、5D）和 TGF-β1（都分别对应为P<0.01，图 5A、5E）。
此外，与对照组相比，模型组Acta2、Mmp2、Mmp9和Tgfb1的mRNA表达上调（都分别对应为P<0.01）。DXM 和高剂量 SAL 治疗下调哮喘模型小鼠中Acta2（图 5F）、Mmp2（图 5G）、Mmp9（图 5H）和Tgfb1（图 5I）的 mRNA 表达（都分别对应为P < 0.01）。
图5 SAL 治疗改善了哮喘小鼠的气道重塑。免疫组化染色检测肺组织α-SMA、MMP2、MMP9、TGF-β1蛋白水平（A）（放大倍数：100×），Image Pro Plus v.6.0定量阳性表达面积（B-E）。结果表明，SAL 处理降低了肺组织中 α-SMA（A、B）、MMP2（A、C）、MMP9（A、D）和 TGF-β1（A、E）的蛋白水平。此外，使用 PCR (F-I) 研究了Acta2、Mmp2、Mmp9和Tgfb1的基因表达。SAL 下调肺中Acta2 (F)、Mmp2 (G)、Mmp9 (H)和Tgfb1 (I) 的基因表达。
4.SAL 对哮喘小鼠肺部代谢物水平的影响
非靶向代谢组学分析用于探索 SAL 对哮喘小鼠肺代谢物的影响。主成分分析 (PCA) 模型显示对照组和模型组分化良好，模型组和 SAL 高剂量组也分化良好。对照组和 SAL 高剂量组之间的距离比对照组和模型组之间的距离更近（图6A）。Adonis 2 检验也显示模型组和对照组之间以及 SAL 高剂量组和模型组之间存在显着差异（表3）。此外，我们使用偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 模型来获得对每种代谢物的投影 (VIP) 的变量影响。与对照组相比，模型组的解释力 (R2) Y = 0.97 和预测力 (Q2) Y =0.56（图 6B），而与模型组相比，SAL 高剂量组的 R2Y = 0.98 和 Q2Y = 0.13（图 6D）。 PLS-DA 模型的置换测试表明该模型稳定且具有良好的预测能力，其数据可用于识别差异表达的代谢物（图 6C、6E）。
图6 非靶向代谢组学显示高剂量SAL影响肺中的代谢物。 (A) 对照组、模型组和SAL高剂量组的 PCA 得分图。 (B, D) 对照组和模型组 (B) 之间以及模型和SAL高剂量组 (D) 之间的 PLS-DA 得分图。 (C, E) PLD-DA 模型在对照组和模型组 (C) 之间以及模型和SAL高剂量组 (E) 之间的置换测试。 (F, G) 对照组和模型组 (F) 之间以及模型组和SAL高剂量组 (G) 之间肺中差异代谢物的通路分析，共同通路用红色表示。
表3 Adonis2主成分分析检验
C：对照组；M：模型组；S：SAL高剂量组。
我们根据以下标准筛选差异表达的代谢物：（1）P<0.05（对照组与模型组之间或模型组与SAL高剂量组之间）； (2) VIP > 1.0（对照组与模型组之间或模型组与SAL高剂量组之间）； (3)倍数变化(FC)>1.2或FC<0.8(对照组与模型组之间或模型组与SAL高剂量组之间)。我们总共鉴定出 34 种代谢物（表 4），与对照组相比，LysoPC 20:2、异丙肾上腺素、7-酮胆固醇、邻苯二甲酸单丁酯、L-高瓜氨酸、柠檬酸、黄体酮和异柠檬酸水平升高，PC (16:0/16:0)、脱氢表雄酮水平升高, 4-胍基丁酸、维生素B2、羟基脂肪酸脂肪酰酯 (FAHFA) (16:0/18:2), 雌三醇、吲哚-3-乙酸甲酯、泛酸、乙酰左旋肉碱、尿苷、睾酮、尿嘧啶、DL-谷氨酰胺在模型组显着降低。 PC (16:0/16:0)、脱氢表雄酮、4-胍基丁酸、维生素B2、FAHFA (16:0/18:2)、雌三醇、甲基吲哚-3 乙酸酯、3-吲哚硫酸盐、2'- O-甲基尿苷、L-天冬酰胺、泛酸、孕烯醇酮、乙酰左旋肉碱、尿苷、睾酮、尿嘧啶和 DL-谷氨酰胺显着增加，而与模型组相比，SAL 高剂量组的 LysoPC 20:2、异丙肾上腺素、7 酮胆固醇、邻苯二甲酸单丁酯、L-高瓜氨酸、柠檬酸、黄体酮和异柠檬酸显着降低（表4）。
表4 哮喘模型小鼠经 SAL 治疗后的差异代谢产物
对照组、模型组和 SAL 高剂量组（每组 n=6）。
RT：保留时间； VIP：投影的可变重要性； FC：倍数变化； ↑：含量增加； ↓：含量减少； vs.：与； C：对照组； M：模型组； S：SAL高剂量组。
a：嘧啶代谢； b：类固醇激素生物合成； c：TCA循环； d：核黄素代谢。
5.差异代谢物的通路分析
我们利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库和MetaboAnalyst平台对模型组差异表达代谢物进行代谢通路富集分析，根据路径影响>0.05和 P<0.05选择不同的路径。结果发现，对照组和模型组之间的差异代谢途径包括嘧啶代谢、类固醇激素生物合成和三羧酸 (TCA) 循环（图 6F）；模型组和 SAL 高剂量组之间的差异代谢途径包括嘧啶代谢、类固醇激素生物合成、TCA 循环和核黄素代谢（图 6G）。在这些途径中，嘧啶代谢、类固醇激素生物合成和 TCA 循环是所有三组共有的途径。
讨论
在这项研究中，我们使用 OVA 开发了哮喘模型。结果表明，模型小鼠肺功能下降。肺组织病理学显示肺组织中有许多浸润性炎症细胞和大量胶原蛋白积累。此外，模型组的肺组织W/D比值、总BALF细胞计数、嗜酸性粒细胞计数和总蛋白增加，表明肺组织通透性增加。模型组的小鼠也表现出较高的血清 IgE 水平，这些结果与哮喘的病理表现一致，说明模型研制成功。此外，结果表明，SAL 干预通过降低肺组织通透性和下调哮喘小鼠的血清 IgE 水平显着改善肺功能。此外，通常用于治疗哮喘的激素药物DXM被选为阳性对照试剂。结果表明，高剂量SAL在改善肺功能方面与DXM无显着差异。结果证实SAL对哮喘有治疗作用，这与之前的报道一致。
气道炎症和氧化应激是哮喘的主要病理表现。因此，我们进一步研究了 SAL 对哮喘小鼠气道炎症和氧化应激的影响。结果表明，SAL 干预降低了哮喘小鼠 BALF中的IL-4、IL-5 和 IL-13 水平，并增加了IFN-γ和IL-10水平。Th1和Th2的平衡对维持机体免疫稳态具有重要意义，二者失衡是哮喘气道炎症发生发展的重要机制。一项研究报告称，哮喘患者的 Th1 水平降低，从而降低了某些 Th1分泌的细胞因子（包括 IFN-γ）水平，并升高了Th2水平，而这又会产生大量的IL-4、IL-5 和 IL13。这些分泌的细胞因子可促进肥大细胞、嗜酸性粒细胞等的活化，引起气道收缩，加重过敏反应的发作。减少Th2相关细胞因子并增加 Th1细胞因子IFNγ，可能有助于减轻哮喘的炎症反应。此外，IL-10是一种重要的免疫调节因子，主要由调节性T细胞 (Treg) 产生，可抑制炎症反应。氧化应激也是哮喘的重要病理反应，长时间的气道炎症会直接导致肺组织产生过多的 ROS。过量的ROS会引起肺部细胞的脂质过氧化和DNA氧化损伤，进一步促进气道平滑肌细胞的损伤。结果还表明，SAL 增加了哮喘小鼠肺组织中的SOD和 GSH-Px活性并降低了MDA水平。MDA是一种细胞毒性脂质过氧化终产物，其水平与氧化应激程度呈正相关。哮喘患者的 MDA 水平升高，并与哮喘的严重程度呈正相关。SOD和GSH-Px都是参与 ROS 清除过程的抗氧化酶。SOD促进 ROS转化为H2O2，其中H2O2进一步转化为H2O和O2，该反应由 GSH-Px 催化。SOD 和 GSH-Px 活性升高可保护肺组织免受氧化应激损伤。
气道壁的结构变化可导致气流阻塞、支气管高反应性和慢性哮喘。本研究还测试了SAL对气道重塑的影响。结果表明，SAL降低了哮喘小鼠肺组织中α-SMA、MMP2、MMP9和TGF-β1的基因表达。哮喘可表现为气道上皮纤维化和气道平滑肌肥大。α-SMA 是气道平滑肌细胞的重要标志物，其异常升高的水平可能表明气道平滑肌过度增长。此外，金属蛋白酶家族成员MMP2和MMP9水平升高会降解气道基质蛋白（例如胶原蛋白和弹性蛋白），导致气道平滑肌中细胞外基质 (ECM) 降解和合成之间的不平衡，这会导致气道中的ECM沉积，促进纤维化并加剧气道炎症和支气管高反应性。 TGF-β1属于转化生长因子家族，其升高的水平促进支气管上皮细胞和平滑肌细胞的增殖。可以通过降低α-SMA、MMP2、MMP9和TGF-β1的表达水平来改善哮喘气道重塑。
接下来，我们使用非靶向代谢组学分析来探讨 SAL 对哮喘小鼠肺部代谢物的影响。 PCA 结果显示哮喘小鼠和对照小鼠的肺组织代谢发生显着变化。 SAL处理后，哮喘小鼠肺组织的代谢率受到显着影响。差异代谢物分析结果表明，SAL 影响了31种代谢物的水平，包括 FAHFA (16:0/18:2)、2'-O-甲基尿苷、L-天冬酰胺、泛酸、乙酰左旋肉碱、PC (16:0/ 16:0)、DL-谷氨酰胺、邻苯二甲酸单丁酯和 L-高瓜氨酸。其中，SAL增加了肺组织中的FAHFA（16:0/18:2）、2'-O-甲基尿苷、L-天冬酰胺、泛酸、乙酰左旋肉碱、PC（16:0/16:0）和DL-谷氨酰胺。FAHFA (16:0/18:2) 通过激活核因子红细胞2相关因子2 (NRF2) 信号通路抑制炎症反应和氧化应激损伤。体外和体内研究发现，2'-O-甲基尿苷可抑制诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 的活性，从而抑制巨噬细胞活化并发挥抗炎作用。L-天冬酰胺还被证明通过抑制脂多糖 (LPS) 诱导的炎症反应而具有抗炎作用。泛酸通常被称为维生素B5，具有抗炎作用。乙酰左旋肉碱具有抗氧化作用，研究发现将其喂食给老年大鼠可显着抑制其氧化应激反应。进一步的研究表明，乙酰左旋肉碱可通过调节细胞内磷脂水平发挥抗氧化和细胞保护作用，从而改善其线粒体功能。PC (16:0/16:0) 是肺表面活性成分的主要成分，在维持肺张力方面起着至关重要的作用。PC水平降低会诱发病理变化，比如肺水肿。DL-谷氨酰胺通过抑制Th2细胞活化来缓解哮喘气道炎症。此外，SAL 降低了哮喘小鼠肺组织中邻苯二甲酸单丁酯和 L-高瓜氨酸的水平。哮喘患者的邻苯二甲酸单丁酯水平显着升高，并且与呼气峰流速呈负相关。此外，一项代谢组学研究将吸烟人群与不吸烟人群进行了比较，发现吸烟人群中L-高瓜氨酸水平明显更高；但L-高瓜氨酸与哮喘的关系尚待进一步研究。
进一步分析差异代谢物的代谢途径表明，嘧啶代谢、类固醇激素生物合成和TCA循环途径是对照组、模型和SAL高剂量组之间发生变化的共同途径。这表明 SAL 治疗哮喘的作用可能是通过这些途径介导的。
1. 嘧啶代谢
SAL提高了哮喘小鼠肺组织中的尿苷和尿嘧啶水平。尿苷和尿嘧啶都是嘧啶代谢中的重要代谢物，其中尿苷具有抗炎活性。一项研究报告称，对卵清蛋白（OVA）诱发的哮喘小鼠施用尿苷可显着降低BALF中的IL-4、IL-6 和 IL-13 水平，下调趋化因子（C-X-C 基序）配体 (CXCL)1、CXCL3、IL-17 水平和mucin-5AC (Muc5ac) 基因在肺组织中的表达，并抑制 MAPK 和 NFκB 通路的激活。因此，SAL抑制哮喘小鼠炎症反应的机制可能与肺组织中嘧啶代谢相关代谢物（如尿苷和尿嘧啶）的上调有关。
2.类固醇激素生物合成
结果表明，SAL上调了类固醇激素生物合成相关代谢物的水平，例如雌三醇、睾酮和孕烯醇酮，而它下调了哮喘小鼠肺组织中的孕烯醇酮水平。类固醇激素生物合成异常与哮喘的发生密切相关。雌三醇、睾酮和孕烯醇酮具有抗炎作用，其中雌三醇抑制免疫细胞在急性肺炎小鼠肺组织中的激活和迁移。临床试验表明，睾酮可抑制炎症反应，而孕烯醇酮可通过调节先天免疫系统发挥抗炎作用。相反，孕烯醇酮会促进哮喘的发展。一项研究报告称，孕烯醇酮通过下调let-7f microRNA 表达来加重哮喘，然后激活 IL-23/IL23 受体信号并促进 IL-17A 的产生。未来的研究可以进一步探讨SAL通过调节类固醇激素生物合成治疗哮喘的作用机制。
3.TCA循环
TCA 循环是身体氧化碳水化合物以产生能量的最有效方式。它是碳水化合物、脂质和氨基酸代谢联络和转化的枢纽。结果表明，SAL降低了哮喘小鼠肺组织中TCA循环相关代谢物（例如柠檬酸和异柠檬酸）的水平。一项研究发现，柠檬酸是一种独特的哮喘诱导剂，其应用可诱发小鼠咳嗽。此外，人们可以通过降低柠檬酸水平来改善哮喘。柠檬酸可在乌头酸水合酶的作用下转化为异柠檬酸。未来的研究可以结合体外实验，进一步阐明SAL通过调节TCA循环，从而改善哮喘的作用机制。
结论
总之，这项研究表明，SAL 治疗可以通过抑制炎症反应和氧化应激以及改善气道重塑来改善哮喘。SAL治疗哮喘的机制可能与调节嘧啶代谢、类固醇激素生物合成和TCA循环有关。本研究使用非靶向代谢组学探索SA治疗哮喘的机制，并为可以调节宿主代谢的天然草药化合物的抗哮喘潜力提供科学证据。未来的研究可以使用靶向代谢组学来验证SAL对哮喘的代谢调节机制。此外，由于代谢的变化与哮喘的炎症反应和氧化应激等病理过程之间存在密切关系，因此可以通过体外模型进一步的研究以详细解释SAL如何通过影响代谢来抑制炎症反应和氧化应激。
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