【写在前面】：本期推荐的是由北京基础医学科学研究所脑科学中心、北京中医药大学生命科学学院、华南大学衡阳医学院附属第二医院神经内科、郑州大学生命科学学院、澳门大学健康科学学院癌症中心等研究团队合作近期发表于Pharmacological Research 的一篇文章，揭示基于网药和生物学验证揭示脑痰清通过调节糖脂代谢和神经炎症改善阿尔茨海默症。
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一种以进行性认知下降为特征的神经退行性疾病，除了传统的Aβ和tau假说外，神经炎症和代谢紊乱也是AD的重要特征。当前该病病因和发病机制尚未完全明确，用于缓解该病的相关药物研究仍处于临床试验中。北京基础医学研究所脑科学中心的Pan Ruiyuan团队与北京中医药大学生命科学学院的Qian Hua团队在本研究中开发了一种新的中药复方脑痰清(NTQ)，并且证明该方可以改善AD。
该文章“Nao Tan Qing ameliorates Alzheimer’s disease-like pathology by regulating glycolipid metabolism and neuroinflammation: A network pharmacology analysis and biological validation”于2022年9月发表于Pharmacological Research杂志。
研究背景
阿尔茨海默症是最常见的与年龄相关的神经退行性疾病，其发病初期表现为编码和存储新记忆的能力受损，后期表现为行为和认知功能的逐渐退化。有大量证据表明，β 淀粉样蛋白(Aβ)和神经原纤维缠结是AD患者突触功能障碍、神经元丧失和认知能力下降的两大原因[1,2]。除此以外，代谢紊乱和慢性神经炎症也与AD密切相关[3,4]。在过去的研究中，一系列单独针对Aβ、tau和神经炎症的药物均不能阻止或延缓AD的进展[5]，这意味着AD可能是一种系统性疾病，涉及多种途径和靶点之间的相互作用。由此可知，单一药物的治疗是有限的，复方药物的协同作用可能为AD的治疗带来更好的选择。
中药复方通常包含多种草药，因其相互作用会引发协同效应，可被用来预防和治疗复杂疾病。已有文献证明，很多中药复方对AD治疗有不错的效果[6]。根据中医理论，“痰”被认为是一种基本致病因素，人们认为“痰”在大脑中的积累驱动了AD的发病机制[7,8]。因此，该文作者根据中医“化痰复苏”理论配制了由胆南星、黄芩、黄连、半夏、天麻、干姜、石菖蒲和甘草组成的脑痰清中药复方。
在该研究中，作者使用网络药理学和实验研究，证明了脑痰清通过抑制神经炎症和调节糖脂代谢来实现对5×FAD小鼠的抗AD作用。
研究内容
Result 1 脑痰清能够降低5×FAD小鼠的认知障碍
为了研究脑痰清对AD的治疗作用，选取2.5月龄的5×FAD小鼠口服脑痰清(5 g/kg/天或50 g/kg/天) 或美金刚(10 mg/kg/天，用作阳性对照) 4个月后，对其进行行为测试和病理分析(图1A)。结果显示各组小鼠的体重没有显著差异，这表明脑痰清在选定浓度内没有明显的副作用（图1B）。Morris水迷宫测试表明，在训练日内，5×FAD小鼠的平均逃逸潜伏期明显长于野生型（WT）小鼠。相比之下，用脑痰清或美金刚组治疗的小鼠的平均逃逸潜伏期明显短于5×FAD小鼠（图1C）。在空间探索测试中，脑痰清或美金刚组的小鼠比5×FAD小鼠穿越平台的次数更多，在目标象限停留的时间更长（图1D，E）。以上数据表明，脑痰清改善了5×FAD小鼠的空间学习和记忆能力，但是五组小鼠的游泳速度没有显著差异（图1F），这表明脑痰清的改善作用不是由运动能力改变引起的。
为了进一步检测小鼠的认知能力，该文作者还进行了一项新颖物体识别（NOR）测试。结果表明，5×FAD模型小鼠对新颖物体没有明显的兴趣，而当5×FAD模型小鼠接受脑痰清或美金刚治疗后，其对新颖物体有了明显的兴趣（图1K）。总之，这些行为测试表明脑痰清能够降低5×FAD小鼠的认知障碍。
图1.脑痰清改善5×FAD小鼠的认知功能。（A）实验时间线。（B）体重差异。（C）Morris水迷宫测试期间的逃生潜伏期。（D）空间探索测试中的目标交叉数。（E）空间探索测试中目标象限停留的时间。（F）小鼠的平均游泳速度。（G）空间探索测试（Morris水迷宫测试）期间小鼠的代表性轨迹图像。（H）空间探索测试（新颖物体识别测试）中小鼠的代表性轨迹图像。（K）新颖物体识别测试中小鼠对新颖物体的兴趣程度。数据为平均值±SEM。*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001，双因素方差分析，Tukey多重比较检验（B和C）或单向（D、E和F）或双尾T检验（K）。
Result 2 脑痰清能够降低5×FAD小鼠大脑中的Aβ负荷
为了研究脑痰清是否影响5×FAD小鼠的Aβ沉积，作者进行了硫黄素S（TS）染色。将脑切片用0.002% TS（溶于50%乙醇）染色8分钟，用50% 乙醇洗涤两次，用PBS洗涤3次。阻断后，将脑切片与其他抗体一起孵育，用于随后的免疫荧光染色或成像。结果表明，与5×FAD对照组小鼠相比，在脑痰清或美金刚给药后，5×FAD小鼠大脑区域（包括皮层和海马）中TS阳性Aβ斑块显著减少（图2A-E），这表明脑痰清可以减少5×FAD小鼠大脑中的Aβ负荷。
图2.脑痰清能够降低5×FAD小鼠的Aβ负荷。（A）TS染色的代表性图像。（B）所示脑区TS染色的放大图像。（C-H）海马DG和CA1区以及指定组小鼠皮层中Aβ斑块（n=5-10个脑切片，每组三只小鼠）的定量。数据为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001,单因素方差分析，Tukey多重比较检验。
Result 3 脑痰清能够抑制5×FAD小鼠胶质细胞的激活
接下来作者研究了脑痰清是否可以阻止胶质细胞的激活。首先将脑切片在TS溶液中孵育，然后分别用抗星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(Iba1)的抗体标记两者的特异性标记物。结果显示，与野生型小鼠相比，在5×FAD小鼠的海马齿状回（DG）和前额叶皮层（PFC）脑区中观察到小胶质细胞和星形胶质细胞的异常激活（图3A、B）。与5×FAD对照组小鼠相比，脑痰清或美金刚治疗的5×FAD小鼠中的这些胶质细胞活化表型被显著抑制（图3C-F），这表明脑痰清可以抑制AD小鼠的神经炎症。
图3.脑痰清能够抑制5×FAD小鼠胶质细胞的激活。（A，B）来自指定组小鼠的海马DG区（A）和PFC（B）中Aβ斑块（TS）、小胶质细胞（Iba1）和星形胶质细胞（GFAP）的代表性图像。（C，D）来自指定组小鼠的海马DG区（C）和PFC（D）中Iba1阳性小胶质细胞的定量（每组3只小鼠，n=5-10个脑切片）。（E，F）来自指定组小鼠的海马DG区（E）和PFC（F）中GFAP阳性星形胶质细胞的定量（每组3只小鼠，n=5-10个脑切片）。数据为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001,单因素方差分析，Tukey多重比较检验。
Result 4 脑痰清化学成分的鉴定
接下来作者用UPLC-MS/MS（图4A）分析了脑痰清中的有效化学成分。结果显示有906个峰，每个峰代表一种化合物，包括226种黄酮类化合物、151种酚酸、88种生物碱、87种有机酸、69种氨基酸及其衍生物、45种脂类和其他类型的化合物。然后，作者通过UPLC-MS/MS研究了脑痰清的植物化学成分及在小鼠口服脑痰清1小时后这些成分在小鼠血清中的吸收程度。结果显示，口服脑痰清后小鼠血清中有175种植物化学成分。结合以上检测结果，依据文献和网络药理学分析数据库，从脑痰清中鉴定出74种活性成分。
Result 5 基于网络药理学预测脑痰清治疗AD的靶点和信号通路
利用SymMap数据库搜索脑痰清74种活性成分相应的靶点，针对相关中药成分的靶点，构建了KEGG通路富集和相关网络图。如图4B所示，前20条通路主要涉及代谢和炎症相关通路，包括PI3K-Akt、AGE-RAGE和HIF-1信号通路。这些结果表明脑痰清可能通过调节与神经炎症和代谢相关的信号通路来治疗AD。
基于药物作用靶点和AD靶点之间的相关性分析，作者构建了药物-靶点-疾病-通路网络分析。结果表明，脑痰清作用于AD的主要活性成分是黄芩素（Baicalein）、小檗碱（Berberine）、芹菜素（Apigenin）和毛蕊异黄酮（Calycosin），主要针对AD病理的相关通路有Aβ、脂质代谢途径、PI3K-Akt、AGE-RAGE和HIF-1信号通路等（图4C）。这些数据证实，脑痰清可以通过靶向神经炎症和糖脂代谢来治疗AD。
图4.网络药理学预测脑痰清治疗AD的靶点和信号通路。（A） 脑痰清的质谱色谱图（阴性模式和阳性模式）。（B）KEGG富集分析显示了脑痰清调节的信号通路。（C）基于药物作用靶点与AD靶点之间的相关性分析，对脑痰清的主要成分进行靶点-通路-疾病网络分析。
Result 6 脑痰清治疗5×FAD小鼠的转录组学分析结果
为了确定与脑痰清疗效相关的生物学因素和信号通路，作者对海马进行了RNA测序。共鉴定出149个差异表达基因，其中42个基因上调，107个基因下调（图5A，B）。进一步对这些基因进行功能通路检测，发现超过100个KEGG生物过程被富集。其中阿米巴病、炎症性肠病、甘油脂代谢途径、局灶性粘连、松弛素信号途径、雌激素信号途径、蛋白质消化和吸收等途径排名靠前（图5D）。此外，研究发现Aldh3b2、Agpat2和Lpin3等与脂质代谢相关的基因是中枢差异表达基因(图5C)。
路径量表结果显示，脑痰清处理后的小鼠的差异基因与5×FAD对照组小鼠的相关差异基因呈负相关(图5E)。NCS值的热映射也证实了该结果（图5F）。接下来，作者通过研究发现超过100条通路由脑痰清调节，在脑痰清治疗后Toll样受体和NF-κB信号、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及氧化磷酸化途径显著富集（图5G）。
图5.5×FAD小鼠海马的转录组学分析。（A）5×FAD和5×FAD+脑痰清小鼠差异表达基因（DEG）的热图。（B）P＜0.05，脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠的DEG的折叠变化（FC）。（C）脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠的甘油磷脂代谢相关DEG水平。（D）脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠中DEG的KEGG富集分析。（E，F）基于通路的相关性分析。在5×FAD对照小鼠与野生型小鼠以及脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠中，NCS（标准化相关评分）值在通路值上的相关性。（G）脑痰清通路关联网络。
Result 7脑痰清治疗5×FAD小鼠的代谢组学分析结果
为了进一步探索脑痰清治疗AD的潜在机制，作者进行了血清非靶向代谢组学的研究。脑痰清处理后的5×FAD小鼠的OPLS-DA得分与5×FAD对照小鼠的OPLS-DA得分明显不同。R2X、R2Y和Q2Y的累积值表明该方法具有良好的预测和解释能力（图6A）。在脑痰清处理的5×FAD小鼠和5×FAD对照小鼠之间，设置VIP>1，P＜0.05鉴定出140种可变代谢物（图6B）。为了获得关于不同代谢产物的功能信息，应用KEGG数据库获得关于差异代谢物的功能信息，鉴定出40种代谢物（图6C）。
应用MetaboAnalyst软件分析不同的代谢通路。结果表明脑痰清处理后，果糖和甘露糖代谢、磷酸戊糖途径、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢等与糖脂代谢相关的通路发生了显著变化（图6D）。基于通路影响值，作者发现果糖和甘露糖代谢以及磷酸戊糖途径是脑痰清组中最显著富集的通路（图6E）。此外，建立了基于差异代谢物的相互作用网络，结果筛选出AD的五个关键靶点：Gba、Pla2g4a、Pla3g6、Lrat和Gapdh（图6F）。总而言之，转录组学和代谢组学结果都表明脑痰清可能通过调节神经炎症和糖脂代谢通路来预防AD。
图6.脑痰清治疗5×FAD小鼠的代谢组学分析。（A）基于代谢组学，脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠的OPLS-DA得分图。（B）脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠的代谢产物的P值（t检验）和VIP（OPLS-DA）。（C）脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠中显著变化的代谢产物的热图。（D）脑痰清处理的5×FAD小鼠与5×FAD对照小鼠之间显著变化的代谢产物的KEGG富集分析。（E） 5×FAD小鼠的主要脑痰清相关代谢通路。（F）关键代谢产物和靶点的网络。红色六边形表示活性成分；灰色菱形代表反应；绿色圆形矩形表示蛋白质；紫色圆形表示基因。关键蛋白质和基因以粉红色背景放大。
Result 8 脑痰清能够降低促炎因子的水平
为了验证脑痰清通过调节神经炎症和代谢发挥抗AD作用的组学数据，作者进行了qPCR分析以评估海马中的促炎因子（图7A）。结果显示与野生型小鼠相比，5×FAD小鼠的促炎因子（包括Il-1β、Il-6和Tnf-α）水平显著升高，而脑痰清处理后，5×FAD小鼠的促炎因子显著降低（图7B-D）。此外，作者还评估了脑痰清中的四种活性化合物对所培养的小胶质BV2细胞的抗炎作用。与体内结果一致，脑痰清中的四种活性化合物显著抑制了脂多糖刺激的BV2细胞的炎症反应（图7E-G）。以上结果表明，脑痰清可以抑制神经炎症。
图7.脑痰清能够降低促炎因子的水平。（A）体内和体外实验的qPCR分析示意图。（B-D）qPCR分析显示小鼠海马中的Il-1β、Il-6和Tnf-α水平（每组4只）。（E-G）qPCR分析显示用或不用脑痰清中的活性化合物处理的BV2细胞中的Il-1β、Il-6和Tnf-α水平（每组n=3）。数据为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，单因素方差分析（B-D）Tukey多重比较检验或双尾T检验（E-G）。
Result 9 脑痰清通过调节糖脂代谢抑制神经炎症
接下来，作者通过实验验证了脑痰清对5×FAD小鼠糖脂代谢的影响。转录组学数据显示，Lpin3和Agpat2是甘油磷脂代谢途径中最关键的中枢差异表达基因（图5C）。qPCR分析表明，与野生型小鼠相比，5×FAD小鼠中Lpin3和Agpat2的mRNA水平显著增加。经过脑痰清处理后，5×FAD小鼠的Lpin3和Agpat2水平显著降低（图8A，B）。为了阐明脑痰清调节神经炎症和糖脂代谢途径的机制，作者用siRNA进行了敲除Lpin3和Agpat2的实验，然后检测了脑痰清中活性成分对脂多糖刺激的BV2细胞中细胞因子的影响。结果显示，与NC细胞相比，siRNA转染的BV2细胞中Agpat2和Lpin3的mRNA水平显著下调（图8C，D）。
接下来，作者研究了在有或没有脑痰清活性成分的情况下，Agpat2和Lpin3敲除后，脂多糖刺激的BV2细胞中促炎因子（包括Il-1β、Il-6和Tnf-α）的水平，结果发现这些成分都具有显著的抗炎作用。与对照细胞相比，Agpat2和Lpin3敲除后的BV2细胞中促炎因子的水平显著降低。需要格外注意的是，与对照细胞相比，某些脑痰清活性成分的抗炎作用在Agpat2和lpin3敲除后的BV2细胞中部分减弱（图8E-G），这表明脑痰清可能通过下调Agpat2与lpin3的表达来抑制炎症。事实上，作者在该研究中所测试的脑痰清活性成分都可以显著降低BV2细胞中Agpat2和Lpin3的mRNA水平（图8H，I）。以上结果表明，脑痰清可能通过调节糖脂代谢来发挥抗神经炎症作用。
图8.脑痰清通过调节Lpin3和Agpat2的表达抑制神经炎症。（A，B）小鼠海马中Lpin3与Agpat2表达水平（每组n=4）。（C，D）qPCR分析显示在相应的siRNA敲除的BV2细胞中Lpin3和Agpat2水平。（E-G）Lpin3和Agpat2敲除后脂多糖刺激的BV2细胞中的Il-1β、Il-6和Tnf-α水平。（H，I）qPCR分析显示用或不用指定的脑痰清活性成分处理的BV2细胞中的Agpat2（H）和Lpin3（I）水平。数据为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001, #P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，*与二甲基亚砜相比，#与LPS相比。双尾T检验（A-D）或单因素方差分析，Tukey多重比较检验（E-I）。
总结与思考
在过去的几十年中，尽管有一些药理学方法用于AD的临床开发，但没有一种方法取得令人满意的结果。因此，寻求治疗AD的新型有效药物和策略仍然是一项迫切的需求。由于AD涉及多种病理损伤，目前的靶向药物开发模型并不理想，这提示我们可以从其他角度考虑AD药物的研发。越来越多的证据表明，中药可以改善认知、调节代谢、抑制神经炎症、减少氧化应激和对抗衰老，与典型的单一化学药物不同，中药复方通常包含多种成分，并与多个靶点或通路相互作用。基于此，该文作者以清除大脑中的“痰”为重点，根据“化痰复苏”理论提出用中药复方脑痰清来治疗AD。
在该研究中，作者运用系统药理学来研究脑痰清的协同效应和机制。首先，作者评估了脑痰清对5×FAD小鼠的治疗潜力。结果表明脑痰清能够降低5×FAD小鼠的认知障碍，此外还能降低5×FAD小鼠大脑中的Aβ负荷。接下来，作者运用UPLC-MS/MS分析出了脑痰清中的有效化学成分，并且运用网络药理学预测了脑痰清治疗AD的靶点和信号通路，结果表明脑痰清可能通过调节与神经炎症和代谢相关的信号通路来治疗AD。神经炎症发生在神经退行性疾病的早期，胶质细胞已被证实通过涉及炎症反应的NF-κB和Toll样受体通路对神经炎症产生影响。在该研究中，作者通过网络药理学和组学分析发现脑痰清可以通过调节NF-κB和Toll样受体途径来抑制AD小鼠的神经炎症。此外，生物学实验也证实了脑痰清可以显著下调促炎因子的水平，并在体内和体外显著抑制胶质细胞的激活。代谢紊乱是AD的另一个早期事件，在先前的研究中表明，AD的发展与糖脂代谢的系统性紊乱之间有着密切的联系。该文作者通过研究发现5×FAD小鼠的鞘脂和甘油磷脂代谢途径受到脑痰清治疗的调节，同时，还发现脑痰清可能通过下调AD小鼠中Lpin3和Agpat2的表达来抑制神经炎症。
综上所述，本文提出了一种新的中药复方脑痰清来治疗AD，并将网络药理学与细胞、动物实验相结合，证明脑痰清可以通过靶向神经炎症和糖脂代谢来改善AD，说明脑痰清是治疗AD的潜在药物。本文启示当一种疾病的发生涉及多种机制时，我们可以从涉及多靶点和通路的中药复方入手，以探求改善该疾病的有效策略。此外，本文将中医药与现代疾病相关联，给我们提供了一种疾病治疗的新思路，为中医药的发展做出了一定的贡献。
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原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.phrs.2022.106489
DOI：10.1016/j.phrs.2022.106489
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