利用“ABPP”策略从复杂的生物环境中探测单磷酸糖基转移酶

英文原题：Probing Monotopic Phosphoglycosyl Transferases from Complex Cellular Milieu

通讯作者：Barbara Imperiali 教授，美国麻省理工学院

供稿人：杨振霖 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Biol.的文章“Probing Monotopic Phosphoglycosyl Transferases from Complex Cellular Milieu” 这篇文章来自于美国麻省理工学院的Barbara Imperiali 教授课题组。在这篇文章中，作者利用了一个双活性官能团的分子探针对单磷酸糖基转移酶进行了细菌上的原位捕捉，并且在多种单磷酸糖基转移酶上验证了该活性探针的普适性。

细菌的糖复合物的生物合成由磷酸糖基转移酶（PGT）在细胞的表面启动，该酶首先催化磷酸糖从可溶性的二磷酸核苷供体中转移到Pren-P的受体中，随后这个膜结合额度PGT产物经过连续的几步糖基化，最终在膜表面进行翻转，为细胞内部的糖复合物的成熟提供了底物，如图1所示。在这个过程中，monoPGT作为在磷酸糖转移过程中的一个关键的酶家族被广泛关注，monoPGT的催化核心一般存在着一个天冬氨酸（图2）正是这个天冬氨酸，为我们设计monoPGT的活性探针提供了分子基础。利用活性探针对monoPGT进行探究有诸多优势，例如，膜蛋白结构本身分离非常困难，如果要把他们分离出来需要若干步骤，过程繁琐。但是利用ABPP（基于活性的蛋白质分析）的策略，就可以从复杂的蛋白质组中高特异性的捕捉我们想要的蛋白进行捕捉和分析。

图1. monoPGT参与下的膜表面连续糖基化

图2.monoPGT的活性口袋及作用机理

在确定好基本策略之后，作者就开始着手设计活性探针来对monoPGT进行捕捉，但是众所周知靶向羧基的活性探针的特异性很差，亲核性更强的氨基酸（例如半胱氨酸或者丝氨酸）都有可能和探针优先反应。作者尝试了若干种共价活性弹头之后，选择了2H-Az（2H-azirine）作为弹头，这种共价弹头的反应基团非常小，而且反应活性稳定，并且也很方便制备2H-Az的衍生物，例如可以合成双功能的2H-Az和炔基的分子弹头，方便在另外一端进行点击化学反应。所以经过活性分析之后，作者选择了带有苯基2H-Az的探针，对monoPGT进行捕捉和分析。

在实验部分，作者选择了来自空肠弯曲杆菌 (Cj) 的 PglC、来自白痢螺杆菌 (Hp) 的 PglC 和来自肉毒杆菌 (Cb) 的 PglB 作为monoPGT的代表性底物进行活性蛋白质分析。作者首先合成了两个探针，第一个探针Az-1的一端带着炔基，另外一端使用了同时连接两个炔基探头的结构(图3A)。随后，作者将这两个探针Az-1和Az-2首先应用于过表达 PglC-His6 (Cj) 的大肠杆菌，从图3B中我们可以看出，过表达Cj的BL21在20kD左右有一条显然强于WT BL21的条带，这证明了我们活性探针确实能够从复杂的细菌环境中精准的捕捉到monoPGT。随后，作者使用了荧光胶，western blot以及考染的方法验证了活性探针的精确性。在确定了活性探针可以捕捉Cj-monoPGT之后，作者探究了monoPGT的活性口袋关键氨基酸的突变是否会引起活性探针捕捉能力的改变，如图3C实验证明，当我们对活性口袋的天冬氨酸与谷氨酸进行突变后，荧光信号确实出现了降低。最后，作者探究了加入探针的浓度是否会影响标记效率，图3D也证明了标记的效率很大程度上取决于探针的浓度。

图3. （A）活性探针的合成 （B）活性探针对monoPGT的捕捉验证（C）活性口袋氨基酸对于活性探针标记的影响 （D）活性探针浓度依赖的对monoPGT进行捕捉

在对模型蛋白进行探究之后，作者理所当然的将底物扩展到Cb以及Hp上，同样采用探针1和探针2对这两种monoPGT进行标记，从标记效果我们也可以看出，无论是从荧光表征，western blot抑或是全蛋白分析，都可以取得良好的标记效率(图4A,B) 。

图4.探针对(A) Cb 以及 (B) Hp的捕捉及分析实验

综上，作者发展了一种能够靶向monoPGT特异性的活性口袋的天冬氨酸或者是谷氨酸的探针，并且利用这种双功能的探针对其进行了捕捉和分析，从复杂的生物环境中特异性的实现了monoPGT的标记，这一项工作又扩展了ABPP的使用范围，作者在最后对未来进行了展望，期望能够使用蛋白质组学的方法对monoPGT展开更深层次的研究，来展示monoPGT的酶相互作用网络。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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