虾青素上调FGF21/PGC-1α 通路减轻非酒精性脂肪肝肝损伤和线粒体功能障碍

Astaxanthin attenuates hepatic damage and mitochondrial dysfunction in non-alcoholic fatty liver disease by up-regulating the FGF21/PGC-1αpathway

研究背景: 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)由肝脏游离脂肪酸(FFA)代谢失衡引起，被认为是最常见的慢性肝病之一，全球患病率约为25% -30%。线粒体的形状多变，含有双膜结构，是 ATP 产生的主要位置和活性氧的主要来源。线粒体在许多细胞活动中发挥重要的调节作用，如氧化应激、细胞凋亡和基因表达。过量的细胞内脂质沉积促进氧化应激反应，产生过量的活性氧，导致线粒体功能障碍和细胞毒性。这促进了恶性循环并加剧了 NAFLD 的发展。生长因子 FGF21是 FGF 家族的内分泌成员，参与多种代谢系统。循环中的 FGF21主要来源于肝脏，其水平与肝功能高度相关。PPAR-γ 共激活因子-1α (PGC-1α)是一种重要的转录共激活因子，是线粒体生物合成和能量代谢的中心诱导剂。证据表明，FGF21可以调节 PGC-1α。虾青素是一种类胡萝卜素，并且具有允许其直接进入细胞并猝灭活性氧和自由基的分子结构，允许其作为天然存在的抗氧化剂，其抗氧化活性比维生素 E 高500倍。在这项研究中，作者评估了虾青素在喂食 HFD 的 C57BL/6小鼠中的作用，HFD 是一种广泛使用的动物模型，并研究了其潜在的机制。

结果1：虾青素通过调节脂质代谢、纤维化和炎症来减轻喂食 HFD 的小鼠的肝损伤

作者建立了一个 HFD 诱导的脂肪肝模型来确定虾青素在非酒精性脂肪肝中的作用，实验的时间过程如图1a 所示。对照组、 HFD 组和虾青素处理组的平均食物摄入量没有显著差异(图1b)。每周测量两次小鼠的体重，图1c 显示虾青素治疗减少了 HFD 引起的体重增加。图1d 表明，与 HFD 组相比，虾青素处理的小鼠肝脏重量较低。不同剂量组有不同的效果，高剂量组体重和肝脏重量变化最明显。血清 ALT 和 AST 的水平如图1e 所示，长期 HFD 可引起 ALT 和 AST 的升高，而虾青素可以剂量依赖性地降低 ALT 和 AST 的升高。另一项生化定量测定显示虾青素可防止 HFD 引起的血脂异常(图1f)。图1g 所示的 H & E 染色显示喂食 HFD 12周的小鼠表现出肝脏脂肪酸浸润的典型外观，这表明脂肪代谢被破坏，还观察到样本中炎性细胞浸润和气球形成。然而，虾青素治疗有效地缓解了这些症状。作者使用 NAS 来评估肝脏的形态学变化(表3)。HFD 组 NAS 评分明显高于对照组，虾青素治疗组 NAS 评分下降明显。在这些分析的基础上，作者选择了60毫克/千克的剂量进行进一步实验。体内研究TUNEL 染色显示 HFD 对肝脏有毒性作用，与对照组相比，模型组肝脏中观察到额外的阳性部位。虾青素处理降低了观察到的毒性。另外，Bax和caspase 9 mRNA 和蛋白表达水平证实了上述结果(图1h-j)。虾青素可逆转模型组 Bax 和 caspase 9的表达增加。因此，我们确保了虾青素在 NAFLD 中的有益作用。非酒精性脂肪肝涉及多种机制，包括脂质代谢改变、细胞因子产生失调、炎症、氧化应激和纤维化。在图1k 中，用油红 O 染色的样品显示虾青素组中脂滴的大小和含量较小并且减少，这表明肝脏脂质沉积减轻。此外，虾青素减少了由 HFD 引起的脂肪细胞增大(图l) ，表明虾青素在一定程度上可以调节肝脏和整个身体的脂质代谢。检测肝脏脂质代谢相关基因的 mRNA 表达，结果如图1m 所示。这些基因包括反映 FFA 合成，分解和运输的 ApoB，ApoE，ADRP，CD36，CPT1α，FATP5，FGF21，FOXA，PGC-1α，SREBP-1c，Tm6sf2和 UCP1的基因。数据表明，虾青素显著抑制脂肪酸摄取，阻断脂肪酸合成，增加脂质分解和脂肪酸氧化。虾青素治疗可显著减少炎性细胞因子的分泌，减轻肝脏炎症。肿瘤坏死因子、白细胞介素 -1β 和诱导型一氧化氮合酶的水平通过 ELISA、 qRT-PCR 和 Western blot 检测表达。这些促炎细胞因子的表达在模型组中增加，但在虾青素治疗后下降(图1n)。如图1j 所示，HFD 几乎没有引起纤维形成。然而，在模型组中，与对照组相比，肝胶原 I，TGF-β1，-SMA 和 CTGF 表达水平显著上调; 虾青素诱导降低(图1o)。

结果2：虾青素抑制游离脂肪酸诱导的肝细胞损伤

作者使用 FFA 处理 L02细胞建立了体外模型。我们用不同剂量的 FFA 和虾青素处理细胞48小时，并使用 CCK8测定法测量效果(图2a)。从这些结果中，发现虾青素的有益作用在30-90μM 范围内呈浓度依赖性，在90μM 时效果最好。因此，在随后的工作中，使用了30、60和90μM 的虾青素。通过流式细胞术确定活细胞和死细胞的比例，结果(图2b)显示与 FFA 孵育诱导约20% 的细胞死亡，虾青素提高了约18% 的细胞存活率。我们还测定了 Bax 和 caspase 9的表达。如图2c-e 所示，Bax 和 caspase 9通过暴露于 FFA 而上调，这种效应被虾青素抑制。虾青素对 Bax 和 caspase 9的保护作用也呈浓度依赖性。油红 O 染色(图2g)和 TG 测定(图2h)的结果显示，虾青素暴露显著降低了 FFA 负载的 L02肝细胞中的脂质浓度，浓度依赖性。图2f 中与脂质代谢相关的基因变化与图1k 中的基因变化相似。这些结果清楚地表明虾青素保护 L02肝细胞免受 FFA 诱导的损伤。

结果3：虾青素的有益作用与线粒体功能的调节有关

线粒体功能障碍在 NAFLD 的发展过程中起着重要作用，氧化磷酸化(OXPHOS)是线粒体功能的重要指标，通过蛋白质印迹(Western blot)测量了 OXPHOS 表达的变化(图3a，b)。在体内和体外加载游离脂肪酸后，OXPHOS 复合物减少，虾青素处理恢复了 OXPHOS 酶活性。这表明虾青素改善了线粒体的生物合成和功能。与对照组相比，FFA 负荷提高了线粒体 ROS 产生水平，虾青素处理降低了线粒体 ROS 产生浓度(图3e)。由于线粒体是 ATP 产生的主要部位，我们进行了研究使用基于荧光素酶的 ATP 测定试剂盒在 FFA 负载的细胞中产生能量。正如预期的那样，游离脂肪酸减少了 ATP 的产生，而虾青素的加入改善了 ATP 的产生(图3c)。图3d 中的图表显示，与在FFA刺激下线粒体生物合成相关的线粒体 DNA 拷贝减少，虾青素干预后显著增加，呈现浓度依赖性。作者还发现，当加载游离脂肪酸时，线粒体膜电位(ΔΨ m)消散了。然而，虾青素以浓度依赖的方式恢复了 Δ残基(图3f)。此外，虾青素显著提高肝细胞中核呼吸因子1(nRF1)和线粒体转录因子蛋白 A (TFAM)的表达，而 FFA 负荷减少了这两种物质的表达(图3g)。通过电子显微镜观察线粒体形态的变化(图3h)。除了脂滴外，我们还观察到 FFA 加载后线粒体中的一些脂质内含物，以及线粒体肿胀、嵴紊乱和基质颗粒增加。

结果4：FGF21/PGC-1是虾青素的靶标，体外过表达或敲低 FGF21均可影响虾青素的有益作用

基于与脂质代谢相关的基因的结果和已经提到的已报道的 FGF21的有益作用，上述虾青素可能与 FGF21和 PgC1α密切相关。因此作者评估 FGF21在其中的表达。作者测量了小鼠血清中循环 FGF21蛋白的水平(图4a) ，发现 HFD 喂养的小鼠血清 FGF21增加。另外，虾青素的使用加剧了这种增加。通过 qRT-PCR 和 Western 印迹检测体内和体外 FGF21基因和蛋白表达水平，获得了一致的结果(图4b)。虾青素剂量依赖性上调 FGF21表达。图4c，d 中的免疫组织化学和免疫荧光结果显示出相同的变化。因此，FGF21似乎参与了虾青素在 NAFLD 模型中的有益作用。据报道，FGF21与 PGC-1α 相互作用并促进 PGC-1α 下游基因的转录。通过 Western 印迹和 qRT-PCR 检测上述图中 FGF21和 PGC-1的统一表达提示虾青素处理可能对 FGF21和 PGC1α之间的相互作用具有积极作用。我们进行了 Co-IP 测定来评估虾青素干预后对FGF21和 PGC-1在 L02细胞中的关系(图4h)。结果表明，虾青素处理后，FGF21可拉低 PGC-1的表达，并使 FGF21/PGC-1复合物水平升高。然后测定 FGF21/PGC-1单独作用及其与虾青素在动物和细胞模型中的协同作用。图4j 显示了转染的 L02细胞的油红 O 染色，图4k 显示了一些与脂质代谢有关的基因的 mRNA 表达水平。总的来说，这些结果显示 FGF21(-)细胞中 FFA 的积累显著高于 FGF21(+ )细胞。虾青素调节脂质代谢的作用在 FGF21(-)细胞中减少，但在 FGF21(+ )细胞中增强。我们还测量了这些转染细胞凋亡的变化(图41)。虾青素对 FGF21(-)细胞凋亡标志物基因和蛋白表达的影响较小，而对 FGF21(+ )细胞凋亡标志物基因和蛋白表达的影响较为明显。因此，我们假设虾青素对肝细胞损伤的保护作用在 FGF21(-)细胞中被抑制。因此，当该化合物具有有益作用时，FGF21可能是虾青素的靶点。此外，我们测定了转染的 L02细胞在有或没有 FFA 和虾青素处理下的线粒体生物合成和功能。ATP，mtDNA 和 mRNA 的结果(图4m)表明虾青素对线粒体的影响在很大程度上依赖于 FGF21的存在。此外，图6a 显示了对细胞凋亡的影响。正如预期的那样，虾青素对负载游离脂肪酸的肝细胞的保护作用被 FGF21下调所抑制。图6b 说明了 FFA 在细胞内的沉积，这些结果是一致的。因此，虾青素降低脂质毒性的有益作用被 FGF21的下调所阻断。

结果5：FGF21的下调加重了 HFD 喂养小鼠的肝损伤

作者将 FGF21 siRNA 注射到小鼠的尾静脉以下调 FGF21的表达并给予虾青素，效果如图5a 所示。进行 ELISA 和 Western 印迹以确认 siRNA 的作用(图5b，c)。食物摄入量也被记录(图5d) ，在 HFD，FGF21(-)和虾青素处理组之间没有观察到差异。这些小鼠的体重每周记录两次。图5e 显示 FGF21的下调引起严重的体重增加，这被虾青素治疗逆转。图5f 显示 FGF21表达较低的小鼠肝脏较重。血清 ALT，AST 和 TG 测定的结果如图5g，h 所示。在长期 HFD 过程中，FGF21表达下调可能会增加肝脏酶指数。图5i，j 中的 H & E 和油红 O 染色显示 FGF21(-)组小鼠表现出更严重的肝脂肪浸润，在虾青素处理组中仅略有改善。脂质代谢相关基因的肝脏 mRNA 表达(图5k)显示与已经描述的结果一致的变化。此外，我们评估了这三组的炎症反应、细胞凋亡和纤维化进展(图51-n)。HFD 可引起 FGF21(-) g 肝损伤加重，虾青素偶尔可减轻 FGF21下调引起的肝损伤。图5o 电子显微镜观察到的线粒体的形态变化。FGF21(-)组肝细胞内脂滴清晰可见。多形性线粒体，基质颗粒增多，膜破裂。此外，我们比较和总结了有无 FGF21基因下调的实验结果，发现虾青素的作用明显受到这种下调的抑制。显微镜下的形态学观察(图6c)和血清检查(图6e)显示，用虾青素处理的 FGF21(-)小鼠的肝脏病理学显著更多。认真的。图6f 总结了这些组间关于炎症、细胞凋亡和纤维化状态的比较。表3显示了 HFD Ax 组与 siFGF21 HFD Ax 组之间的比较。缺乏 FGF21可降低虾青素的保护作用。

讨论

正如上述实验结果所示，FGF21的表达与脂质沉积、炎症反应、纤维化和细胞凋亡密切相关。低水平的 FGF21导致 HFD 或 FFA 诱导的肝细胞损伤加重，FGF21过表达减轻了肝细胞损伤。此外，通过比较虾青素在不同状态下 FGF21表达的作用，FGF21的下调抑制了虾青素对 HFD 或 FFA 诱导的肝细胞损伤的作用，这表明 FGF21与虾青素抑制脂质积累，炎症，纤维化和细胞凋亡的功能密切相关。此外，FGF21的表达发生变化后，PGC-1α 的表达也发生了相应的变化。虾青素可作为 FGF21激动剂上调 FGF21/PGC-1α 系统以抑制脂肪肝的进展。这代表了虾青素改善 HFD 诱导的脂肪肝的一个以前未被发现的机制。作者已经证明虾青素减少喂食 HFD 的小鼠和用 FFA 处理的 L02细胞系中的肝 TG 积累，并且减轻由脂质诱导的炎症，细胞凋亡和纤维化。虾青素治疗通过恢复 OXPHOS 复合物和 ATP 水平显著改善线粒体的生物合成和功能，从而降低 ROS 产生并增加线粒体 DNA 拷贝数。虾青素通过可能涉及 FGF21/PGC-1α 上调的机制降低实验性脂肪性肝炎的严重程度。该研究证实虾青素可能成为治疗或缓解非酒精性脂肪肝的有前途的药物。

转自：“如沐风科研”微信公众号

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