细胞冻存的坑，到底怎么破？一文读懂细胞冻存那些事儿！

常常听到萌新师妹抱怨，细胞冻存得好好的，后面想用时怎么就用不了呢？

实际上，细胞冻存的重要性不亚于细胞培养。丁香实验在此对细胞冻存的原理及方法步骤进行梳理，希望能够帮助到为细胞冻存实验「头秃」的科研人。

一、细胞冻存的原理

传统的细胞冻存（甘油/二甲基亚砜作为保护剂）实验讲求的要点是：慢冻速溶。

细胞冻存时向培养基中加入的甘油或二甲基亚砜（DMSO），这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

当细胞生长至对数中晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻，后转移至液氮环境中长期保存。

二、细胞冻存的步骤

1.  预先配制冻存液：按正常培养基：DMSO =9:1比列配制冻存液；

2.  取对数生长期细胞，用胰蛋白酶将单层生长的细胞消化下来，离心转速为1000 rpm，离心时间为5 min；

3.  去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量提前配制好的细胞冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/mL～1×107/mL；

4.  将细胞分装入冻存管中，每管体积约为1～1.5 ml；

5.  在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间、细胞代数及操作者的名字，以便于后续溯源信息；

6.  提前往冻存盒中加入异丙醇（在负八十冰箱中能以1℃/min的速度下降），随后放入-80℃的低温冰箱即可，建议冻存时间为12小时以上。冻存完成的细胞一般能够在-80℃冰箱中保存半年至一年，长期保存要转移至液氮中，商用冻存液可以直接将冻存管放置于-80℃冰箱中。

转自：“丁香学术”微信公众号

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