蛋白质荧光标记探针解析跨膜碳酸酐酶的胞外域脱落

英文原题：Protein-Labeling Fluorescent Probe Reveals Ectodomain Shedding of Transmembrane Carbonic Anhydrases

供稿人：张妍，北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Biol.的文章“Protein-Labeling Fluorescent Probe Reveals Ectodomain Shedding of Transmembrane Carbonic Anhydrases”，文章来自国立清华大学的陈贵通课题组。在这篇文章中，作者们利用基于亲和力的蛋白质荧光标记探针来研究跨膜蛋白的胞外域脱落过程。作者们分析了肿瘤缺氧条件的重要生物标志物——细胞表面碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)的胞外域脱落，并且通过化学与遗传方法鉴定了影响其脱落的重要金属蛋白酶ADAM17。与当前常用的免疫学方法相比，该蛋白标记的方法不仅可以对跨膜蛋白脱落至培养基中的胞外区进行有效检测，并且可以通过活细胞实时跟踪与细胞膜表面残留蛋白定量分析详细了解蛋白胞外域脱落机制与细胞膜表面蛋白寿命。（图1）

蛋白质的胞外结构域脱落是一种有限的蛋白质水解过程，蛋白酶通过裂解跨膜蛋白，从而将其胞外结构域自细胞表面释放。这种脱落机制在多种正常生理和病理过程（如细胞粘附、生长因子信号传导、炎症反应和细胞存活）中非常重要，由蛋白质外膜片段释放不足或过量引起的脱落失调已被发现与许多严重疾病有关。因此，详细探究蛋白质的胞外结构域脱落过程对于基础生物学和医学研究十分重要。细胞表面碳酸酐酶XII (CAXII)是一种由缺氧诱导因子诱导产生的细胞表面糖蛋白，其在多种肿瘤中异常表达，并通过酸化缺氧细胞的微环境和调节细胞粘附能力参与肿瘤侵袭。研究CAXII的表达、活性、寿命和胞外区脱落有助于阐明肿瘤的侵袭性。但目前，CAXII的胞外域脱落尚未见报道，其释放的分子机制仍不明确。

图1. 蛋白质荧光标记策略研究蛋白外畴脱落流程示意图

在这篇文章中，作者们首先设计并合成了一种基于亲和力共价标记细胞膜表面CAXII的荧光探针。（图2a）该探针包含可与CA结合的磺胺配体、荧光素染料和二氟苯酯反应亲电试剂三部分，可以在结合膜外CAXII后与其发生共价连接。在验证了该探针与CAXII体外标记的特异性后，作者将其应用到A549与MCF7细胞系上，成功实现了活细胞表面的CAXII标记与细胞膜表面残留蛋白及培养基中游离胞外域的有效检测。（图2b-d）

图2.a. CAXII的选择性标记示意图；b. 荧光探针标记CAXII的特异性检验；c. A549与MCF7细胞系膜表面CAXII的选择性标记；d. MCF7和A549细胞膜表面残留蛋白及培养基中游离胞外域的凝胶电泳检测

接下来，作者利用该方法对不同条件处理下MCF7和A549细胞系的表面CA的胞外域脱落过程进行了详细的探究。首先他们利用荧光成像与凝胶电泳对正常生理状态下的两种细胞CA的脱落周期进行了探究，结果表面随着时间的增加，细胞膜表面荧光逐渐衰减，指示了其上CA蛋白的脱落过程，且A549具有更快的脱落速率。（图3a, b）之后，他们对不同条件处理下的细胞进行了CA胞外域脱落速率的探究。作者利用一系列影响CA脱落的药物对细胞进行处理，结果表明，该方法可以有效且定量的表征不同CA脱落速率的差异。在脱落激活剂PMA的处理下，12h后细胞膜表面残留荧光信号显著降低，且其衰减速度也有明显提升。（图3c, d）此外，研究者们通过模拟肿瘤低氧环境探究其对CA脱落的影响，但结果显示，低氧环境并未对CA的胞外区脱落速率造成显著影响。研究者推测肿瘤低氧环境可能通过产生更有催化活性的CA胞外结构域和增强CA表达来增加肿瘤细胞周围的酸性。（图3e）

图3. 探针标记 0、6、12、24 h后MCF7和A549细胞的荧光成像结果；b. 标记后MCF7和A549细胞裂解物和培养基的凝胶电泳荧光成像结果；c. 不同药物处理12h后A549细胞表面CA胞外域脱落情况；d. 脱落激活剂PMA处理下CA脱落情况表征；e. 低氧条件下CA脱落情况表征

此外，作者们通过金属蛋白酶抑制剂及基因敲除的方法验证了影响其脱落的重要金属蛋白酶ADAM17。通过成像与凝胶电泳分析，他们发现ADAM17 KO的细胞无论在正常条件抑或是外加脱落激动剂的条件下均无法有效发生CA的胞外域脱落过程，表明CA的胞外域脱落是由ADAM17介导的蛋白水解启动。（图4）

图4.a. 正常或药物处理下野生型和ADAM17(KO) A549细胞标记后12h的荧光成像结果；b. 野生型和ADAM17(KO) A549细胞标记后细胞裂解物的凝胶电泳荧光成像及定量分析结果

总结来说，作者们通过亲和荧光探针共价标记细胞膜表面CA的策略探究了其不同生理条件下的胞外域脱落过程。该方法通过细胞荧光成像、游离胞外域及细胞膜表面残留蛋白定量分析详细解析了CA蛋白胞外域脱落的时间进程、影响因素，并且验证了与其相关的重要金属蛋白酶ADAM17，为详解CA生理学功能提供了有利帮助。此外，该策略也提供了研究膜蛋白胞外域脱落新思路，有助于解析蛋白质胞外域脱落机制及细胞膜表面蛋白质的寿命。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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