一种新型的检测单细胞中特定基因组位点染色质压缩状态的方法

通常染色质有三种状态：活性、抑制性以及非活性，染色质的压缩状态是影响DNA之间互作的关键物理性质。然而，目前缺乏直接检测特定基因组位点染色质压缩状态的工具。

2022年11月5日，来自瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤和细胞生物学系的Magda Bienko教授团队在Nature Communication杂志发表了题为“FRET-FISH probes chromatin compaction at individual genomic loci in single cells”的研究论文，该研究结合荧光共振能量转移（FRET）和DNA荧光原位杂交（FISH）的方法来检测单细胞中特定基因组位点的染色质压缩状态，填补了该领域的空白。

FRET-FISH基于DNA FISH探针杂交组成的寡核苷酸耦合两个荧光染料重叠光谱靶向两个近端DNA序列，因此，如果两个序列接近于100 A（取决于使用的FRET染料对）就可以检测到FRET。作者推测，一个由多个寡核苷酸组成的探针针对给定的基因组位点，并携带交替的FRET（D）和受体（A）染料，能够通过测量产生的FRET信号来检测该基因座的染色质压缩状态。由于FRET的效率受偶极去向以及D和A染料之间的分子距离的影响，作者最初设计了三种不同的FRET-FISH探针。在这三种情况下，作者将每个探针设计为包含初级D-A寡核苷酸对，初级D寡核苷酸的T序列的3’与下一个初级A寡核苷酸的T序列的5’之间的最小距离为5nT。研究结果表明通过测量固定细胞中产生的FRET信号，可以检测到携带交替FRET受体和供体染料的原位杂交寡核苷酸之间的接近程度（图一）。

然后，作者试图进一步优化FRET-FISH探针设计，用来检测特定基因组位点上的局部染色质压缩状态。因此，作者设计了被更大的线性基因组距离隔开的D和A寡核苷酸组成的探针，旨在增加G4-S300的距离。所有六种探针都产生了可检测的FRET信号，但是FRET-FISH分数分布因探针不同而异。对于G1-S50、G1-S150、G2-S50，分数分布相对较宽，表明它们能够检测一系列染色质压缩状态。此外，G1-S150和G2-S50明显是双峰分布，右侧的较高模式以及左侧的较低模式可能对应于较不紧密的染色质状态（图一）。

接下来，作者评估了FRET-FISH的重复性并且对该方法进行了验证。首先针对小鼠chrX上的留个基因设计了FRET-FISH探针，六个探针在G1期细胞中获得了预期的FISH分数以及可重复的FRET-FISH双峰分布，这表明这些基因座可以在两种不同的染色质压缩状态下找到（图二）。重要的是，FRET-FISH的分数分布在实验重复之间高度相关，突出了FRET-FISH的重复性。由于染色质可及性的缺乏可被用作染色质压缩状态的替代指标，作者比较了FRET-FISH和ATAC-seq在同一个细胞系中测量的染色质可及性。对于chrX上的六个基因，FRET-FISH的平均分数与相应的ATAC-seq分数呈负相关，表明局部染色质压缩和可及性是相关的（图二）。然后作者使用荧光寿命成像显微镜（FLIM）来验证FRET-FISH，结果表明FRET-FISH结合FLIM可用于评估局部染色质压缩状态。

然后，作者想要探究FRET-FISH分数分布中的双峰性是否会受到细胞周期的影响。为此，作者计算了chrX上三个基因座在细胞周期的不同阶段的FRET-FISH得分。正如预期那样，有丝分裂细胞的FRET-FISH分数显著高于G1期细胞（图三）。值得注意的是，在两个独立的实验中，非G1细胞的FRET-FISH分数显著低于G1细胞，这反映在非G1细胞中FRET-FISH分数双峰分布的减少，这些结果与之前基于ATAC-seq的观察结果一致。结果表明，给定基因座的染色质状态受到细胞时期的影响，并突出了FRET-FISH在细胞周期不同阶段区分不同染色质状态的能力。

最后，作者研究了FRET-FISH分数分布的双峰性是否会受到细胞衰老的影响，这与结构性异染色质的丧失以及常染色质的沉默有关。作者假设随着细胞传代的增加，在经历衰老的细胞中活性基因染色质的紧凑性可能会逐渐增加。结果表明，培养十代以上的细胞表现出更高的染色质凝聚。值得注意的是，两个DNA损伤标志物的含量也随着传代次数的增加而增加，这表明DNA损伤水平的增加可能与观察到的染色质凝聚有关（图三）。

综上所述，作者开发了一种方法来检测选定基因座上的染色质压缩状态，该方法同时结合了DNA FISH的特异性和FRET的敏感性。在未来，FRET-FISH可能不仅被用来检测特定基因组区域的染色质压缩状态，而且还可以用来研究结构基因组学的一些重要方面。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-34183-y

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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