碱基编辑器由融合到脱氨酶上的可编程DNA结合蛋白组成，可以在目标基因组位点上实现精确的核苷酸改变，而不需要双链断裂。目前的CBE可将C•G碱基对转化为T•A，由胞苷脱氨酶融合到Cas9镍酶或TALE重复序列和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor, UGI)域组成。
2022年11月10日，哈佛大学/Broad研究所刘如谦（David R. Liu）实验室在Nature Biotechnology杂志在线发表题为“Evolution of an adenine base editor into a small, efficient cytosine base editor with low off-target activity ”的论文，该研究进化了高活性脱氧腺苷脱氨酶TadA-8e，通过噬菌体辅助的连续进化来进行胞苷脱胺。进化出的TadA胞苷脱氨酶包含DNA结合残基的突变，改变了酶的选择性，使其强烈倾向于脱氧胞苷而不是脱氧腺苷脱氨。与常用的CBE相比，TadA衍生的胞嘧啶碱基编辑器(TadA-derived cytosine base editors, TadCBEs)具有类似或更高的靶上活性、更小的体积和更低的Cas独立的DNA和RNA脱靶编辑活性。
此外，还发现了一个TadA双碱基编辑器(TadA dual base editor, TadDE)，它可以进行同样高效的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑。TadCBEs支持原代人T细胞和原代人造血干细胞和祖细胞中与治疗相关的基因组位点上的单或多碱基编辑。TadCBEs扩展了CBE在精确基因编辑方面的用途。
迄今为止发表的所有CBE都利用自然发生的胞苷脱氨酶作用于DNA或其实验室工程变体。ABEs将A•T碱基对转换为G•C。因为没有已知的天然酶能脱氨脱氧腺苷，先前进化出一种作用于转移RNA (tRNA)以接受DNA底物的腺苷脱氨酶TadA-7.10。迄今为止报告的所有ABEs，包括那些已经在临床试验或获准进行临床试验的ABEs，都使用TadA-7.10或这种脱氨酶的进化或工程后代。
ABEs表现出许多精确基因编辑所需的特性。尽管野生型TadA具有强烈的tRNA底物偏好，但当前的ABE变体，如ABE8e，通常比现有的CBE具有更高的编辑效率。与大多数CBE脱氨酶相比，TadA酶的过程性较差，因此通常能实现更高的单核苷酸编辑精度。与CBEs相比，ABEs还提供较低水平的独立于Cas的脱靶编辑。这种优势可能来自于与野生型TadA (tRNA stem的APOBEC1 Km = 830 nM)相比，常用的胞氨酸脱氨酶与核酸底物更紧密的无辅助结合(例如，mRNA的APOBEC1 Km = 0.21 nM)，野生型TadA无法处理DNA，以及仅以Cas依赖的方式进化TadA-7.10的事实。基因组挖掘和蛋白质工程已经提供了具有较低Cas独立DNA和RNA编辑能力的替代胞苷脱氨酶，但到目前为止，这些变体的靶上编辑活性降低和/或尺寸增大。
在166个氨基酸中，进化出的TadA脱氧腺苷脱氨酶远远小于常用的胞苷脱氨酶，如APOBEC1(227个氨基酸)、AID(182个氨基酸)、CDA(207个氨基酸)或A3A(198个氨基酸)，这使得TadA衍生的碱基编辑器更容易通过限制大小的方法(如腺相关病毒(AAV))传递到细胞中。事实上，TadA的小尺寸使得ABEs(而不是CBE)能够通过单个AAV进入活体动物组织。
在这项研究中，研究人员使用噬菌体辅助的连续和非连续进化(PACE和PANCE)来改变TadA-8e的底物特异性，产生了一类新的选择性胞苷脱氨酶(TadA-CDs)和CBE。为了实现胞苷脱氨基，研究人员使TadA-CD变异体在活性位点附近与DNA骨架相互作用的残基处发生突变。TadA-CD胞嘧啶碱基编辑器(TadA-CD cytosine base editors, TadCBEs)在哺乳动物细胞中具有高度活性，与目前的BE4max、evoAPOBEC1-BE4max (evoA)和evofanny -BE4max (evoFERNY) CBE相比，其C•G-to-T•A编辑效率类似或更高。
图1. TadA-8e胞苷脱氨酶的噬菌体辅助进化（图源自Nature Biotechnology ）
进一步脱靶分析表明，与广泛使用的基于APOBEC的CBE变体相比，TadCBEs诱导的Cas独立脱靶DNA和RNA编辑更低。V106W突变的添加进一步减少了TadCBEs的脱靶编辑，改进了它们的编辑窗口，提高了C•G到T•A的选择性，同时保持了脱靶编辑效率的峰值。
图2. TadA-8e变异的进化和特征（图源自Nature Biotechnology ）
通过使用小鼠胚胎干细胞(mESCs)中10,638个基因组整合、高度可变的靶点库对进化的TadCBEs进行了广泛的特征描述，以确定TadCBEs的选择性和序列上下文偏好。结果表明TadA-CDs还兼容SpCas9 (PAM = NGG)、进化出的eNme2-C Cas9 (PAM = N4CN)变体和SaCas9 (PAM = NNGRRT)，促进了广泛的靶标可及性。最后，研究人员证明TadCBEs可以用于原代人T细胞中治疗相关位点的高效多路胞嘧啶碱基编辑，以及原代人造血干细胞和祖细胞(HSPCs)中治疗相关位点的胞嘧啶碱基编辑。
总的来说，这些发现揭示了一个新的小型CBE家族，它们具有高靶点活性、易于精确碱基编辑和低脱靶活性的定义明确的编辑窗口。这些研究结果也证实了脱氧腺苷脱氨酶进化为选择性脱氧胞苷脱氨酶的潜力。
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https://www.nature.com/articles/s41587-022-01533-6
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