福建师范大学欧阳松应团队揭示CRISPR/Cas12c1系统对靶DNA识别和切割的分子机理

Cas12c是最近发现的V-C型CRISPR-Cas(规律间隔成簇短回文重复序列和CRISPR相关蛋白)系统的双RNA引导的DNase效应子。由于对原间隔相邻基序(PAM)的要求最低，Cas12c是基因组编辑的一个有吸引力的候选对象。

2022年11月2日，福建师范大学欧阳松应团队在Nucleic Acids Research（IF=19）在线发表题为“Structural insights into target DNA recognition and cleavage by the CRISPR-Cas12c1 system”的研究论文，该研究通过CRISPR-Cas12c1系统进行了对靶DNA识别和切割的结构研究。该研究报道了报告了Cas12c1与单向导RNA（sgRNA）和含有5'-TG-3' PAM的靶双链DNA（dsDNA）复合的晶体结构。本研究通过生物化学和突变分析，揭示了Cas12c1及其相关sgRNA的明显结构特征，以及PAM识别、靶dsDNA解缠绕、异源双链体形成和识别、非靶DNA链和靶DNA链裂解的分子基础。

Cas12c1通过一种依赖于序列一致性和Cas12c1诱导的PAM区域构象畸变的机制来识别PAM。Cas12c1的另一个特点是非靶DNA链和靶DNA链都在一个单一的、均匀的位点上裂解，裂解能力和裂解顺序难以区分。该研究还确定了sgRNA种子区域的位置和触发Cas12c1 DNase活性所需的靶DNA的最小长度。总之，该研究的发现为将CRISPR-Cas12c1系统开发成高效、高保真的基因组编辑工具提供了有价值的信息。

CRISPR-Cas是原核适应性免疫系统，通过部署Cas效应核酸酶与CRISPR RNA (crRNA)配对，识别和分裂与crRNA的引导(也称为间隔)部分互补的外来核酸序列，保护宿主免受噬菌体的感染。根据Cas效应子的特点，将CRISPR-Cas系统分为第1类和第2类。第2类系统(II型、V型和VI型系统)使用crRNA引导的单个多域Cas效应子进行核酸干扰。一些第2类系统的效应子还需要一个额外的被称为反式激活crRNA (tracrRNA)的RNA分子，它与crRNA杂交形成功能性RNA导向。由于其高效、靶向可编程性和易于使用，一些2类效应器已成功地重新用作核酸切割或结合工具，用于基因组编辑、转录组编辑、核酸诊断和成像以及其他应用。II型系统中的Cas9和V-A型系统中的Cas12a (Cpf1)被广泛用于基因组编辑，V型效应器Cas12b (C2c1)、Cas12e (CasX)和Cas12f (Cas14a)也被用于此目的。

尽管crRNA间隔可以被设计成允许编辑几乎任何基因组序列，但DNA靶向Cas效应器还需要在目标序列两侧存在一个正交特异性短序列，称为原间隔相邻基序(PAM)。PAMs能够在原生环境中区分自我和非自我，但限制了基因组编辑中的目标选择。例如，常用的Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)需要5’-NGG-3'PAM限制了人类基因组中可靶向位点的可用性，大约每8个碱基对有一个位点。因此，人们正在努力通过工程目前可用的Cas效应器或识别新的类型和变体来放松PAM强加的目标限制。

靶DNA双链体展开和异源双链体形成（图源自Nucleic Acids Research ）

最近，带有功能发散效应器的新型V型系统被发现，这可能会扩展CRISPR-Cas工具箱。其中，V-C型系统的特征效应子Cas12c(原名C2c3)是一种双RNA引导的DNA内切酶，其大小与常用的Cas9和Cas12a变体相似。与其他V型效应子类似，Cas12c在其C端区域包含一个RuvC核酸酶结构域，但其一级序列的其余部分与除Cas12d以外的任何其他Cas效应子没有显著相似性。

V-C型效应器在被称为scoutRNA的tracrRNA分子存在的情况下处理自身的前体crRNA (pre-crRNA)。与Cas12a不同，Cas12c效应器利用RuvC活性位点以金属离子依赖的方式切割间隔序列下游的pre-crRNA。最值得注意的是，发现Cas12c变体受最小PAMs的约束—Cas12c1和Oleiphilus sp. HI0009 Cas12c (OspCas12c)受5’-TG3'PAM限制和Cas12c2被5’-TN-3'PAM限制。因此，Cas12c效应器可以极大地扩展CRISPR-Cas基因组编辑的靶向空间。然而，Cas12c对PAM的识别和靶DNA切割的分子机制仍然不清楚，从而阻碍了有效的应用。

在这里，该研究报道了Cas12c1的晶体结构与共价融合的crRNA和tracrRNA和双链靶DNA包含5'-TG-3' PAM。该结构揭示了Cas12c1和相关sgRNA的独特结构特征，以及与其他V型CRISPR-Cas系统的某些相似之处。该研究发现Cas12c1能识别5'-TG-3' PAM主要通过PAM-相互作用(PI)环和一种依赖于序列一致性和Cas12c1诱导的PAM区域构象畸变的机制。

Cas12c1的另一个显著特征是非靶DNA (NTD)和靶DNA (TD)链都在一个单一的、统一的位点上裂解，其容量和顺序难以区分。此外，作者还鉴定了靶DNA双链体展开、TD引导的异源双链体形成和识别以及NTD链加载到DNase活性位点的关键结构元素和残基。种子区域的位置、双链和单链DNA靶的最小长度、温度和二价金属离子对Cas12c1催化活性的偏好也被确定。总之，该研究的发现为CRISPR-Cas12c1系统在基因组编辑和其他应用中的有效利用奠定了基础。

原文链接：

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac987/6793814?searchresult=1

转自：“iNature”微信公众号

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